看见神经：从卡哈尔到现代神经解剖学 | 神经专栏
► 大脑的扩散核磁共振（diffusion MRI）
撰文 | 贾晓宁、李德康、李天昊、涂洪清（上海科技大学）
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自人类拥有智慧以来，“认识自身”就是我们一直试图达到的、朴实又富有深刻哲学内涵的目标。追溯生命意识的起源和形成、揭示生命各项活动的“灵性”的本质，生命科学在此过程中逐渐诞生、成型。神经科学，这一学科向智慧的根源的探求在这认识自身的漫长图卷中如同丹砂青雘，既为基础，又显华美。
认识大脑的现代神经科学发源于19世纪末20世纪初。如同绝大多数的科学门类需要一个天才以及天才的理论来奠定基础，神经科学的正式确立离不开伟大的病理学家、组织学家圣地亚哥·拉蒙-卡哈尔（Santiago Ramóny Cajal）的研究成果和理论。为此，卡哈尔被誉为“现代神经科学之父”。
在神经科学的研究中，最重要的技术就是成像观察技术。人类只有借助不断发展的观测技术，更加细致地观察到神经系统的真实模样，才能更好地理解它的功能、研究它的状态。而神经系统承载着至关重要的功能，决定了它是生命体中最复杂的、最难观察的结构。这也就导致了人类对神经科学的研究，始终伴随着标记和成像等技术的发展而前进。
► 圣地亚哥·拉蒙-卡哈尔
早在1873年，意大利科学家卡米洛·高尔基首创铬酸盐-硝酸银染色法，将解剖获得的组织中的神经元和胶质细胞的细胞体和突起染成棕黑色，而未被染色的细胞呈无色，易在光学显微镜下观察、用手绘图片记录。这是人类最早的神经科学观察成像技术。这一染色方法也被命名为“高尔基染色法”。
► 卡米洛·高尔基
卡哈尔在同一时期也在积极开展神经组织的解剖、观察和研究。他对高尔基染色法有所改进，即换用了更高浓度的重铬酸钾、延长了第二步硝酸银浸泡暗处理的时间，从而获得了更充分可靠的染色样本。在高尔基心爱的Zeiss光学显微镜下（他任教于巴伦西亚大学期间受到的奖励，在他的自传中他强烈表达了自己彼时的喜悦），凭借着自己高超的观察能力和绘画技艺，他完成了数百幅美观、细致的神经解剖学绘图。这些绘图后来长期被用作教学的范本，直到现在仍然可以出现在教材的对应章节中。
之所以说卡哈尔是天才，绝不仅仅因为他针对客观事物细致入微的观察以及严谨而认真的记录，更是因为他对神经结构功能的理解和分析。卡哈尔确定了若干个重要的规律，并且在研究中始终贯彻：
神经系统由神经元这样的基本单位构成，但在研究功能时，需要整体考虑各个结构之间的相互作用；
神经信号（卡哈尔的用词是‘nervous current’）的传导大多是单向的，由树突到神经元细胞体再到轴突；
神经元之间是生理结构上不连续的，神经信号可以跨过这种不连续的结构而传递下去。
基于这些规律，卡哈尔对于观察到的解剖结构如何发挥功能的过程也有详尽的分析与猜想。下面是一个典型的例子。
► 上图是卡哈尔绘制的脊椎动物视神经相关通路的图片。在图中，卡哈尔已经绘制出了神经之间不连续的结构（后人命名为突触），并且解释了低等脊椎动物（左图）和高等脊椎动物（右图）在神经系统相关组织结构上不同的原因。
后人在更先进的技术以及更精密的仪器支持下，证明了卡哈尔的结论正确性。作为染色方法真正的发明人的高尔基在同一时期提出了截然不同的结论，即神经联结成为网络，没有单向传导、生理不连续的特征。直到1906年二人都因为在神经科学领域的巨大贡献被授予诺贝尔奖。当他们站到颁奖台上的那一刻，分歧仍然没有弥合。卡哈尔是幸运的，他得到了更接近事实的结论，所以被誉为了“神经科学之父”，但高尔基也没有被历史遗忘，更多人所熟知的细胞器——高尔基体，正是以他的名字命名的。
高尔基银染法是跨时代的，但不足以支撑对神经元更深入、更细致的研究，染色的方法既不能揭示神经纤维之间的联系，也不能界定特定神经元的完整分布区域，多个神经细胞的轴突、树突交叉在一起时，很难判断一段神经纤维属于哪一个或哪一群胞体；况且切片后的神经组织难以观察到完整的神经元。在如此艰难的情况下，也无怪乎高尔基把神经当做连接起来的网状结构了。
科学永不止步，卡哈尔凭借其天才的观察力和想象力，从粗陋设备获得的模糊数据得出了精确的结论。
20世纪70年代以来，一种新型的利用神经示踪剂（tracer）观察神经细胞形态的方法逐渐发展起来。注入在神经细胞附近的示踪剂会被神经元特异性吸收，示踪剂在神经元内依靠细胞内的转运功能扩散到神经元的各个角落，以此达到示踪的目的。顺行示踪剂（anterograde tracer）在细胞内顺着信息流的方向扩散，也就是在胞体部位注射示踪剂，示踪剂向神经末梢传递；逆行示踪剂（retrograde tracer）与之相反——在神经末梢部位注射，示踪剂逆信息流方向传递。
然而传统示踪剂并不是完美的。人们认为，理想的示踪剂需要具备如下五点特性：第一，它能特异性且高效得被神经元细胞吸收；第二，它能靶向一类特定的动力蛋白，表现出特异地顺行或逆行传导；第三，它的信号可视化且能够被稳定地放大；第四，其可应用多种颜色以便使用多种示踪剂；第五，一些示踪剂可以信号不衰减地跨突触传递。
► 不同示踪剂的注射方法
嗜神经病毒是一类可以感染神经细胞，且能沿神经环路增殖传播的病毒。20世纪末，人们已经开始改造并利用这类病毒的疫苗株作为全新的示踪剂，且一直沿用至今，成为了目前最高效的一类示踪剂。
嗜神经病毒在细胞特异性、示踪效率、跨突触示踪方面显著优于传统示踪剂。特别是近年，在反向遗传学和同源重组基因编辑技术飞速发展下，人们对病毒示踪剂的运用更加灵活和广泛。在疫苗株的基础上，改造病毒基因组，敲除特定毒力基因，插入荧光蛋白等外源基因，获得低毒力、安全、携带标示物的重组示踪工具病毒。
根据病毒示踪剂能否扩增从而跨突触标记，可分为两大类。不能跨突触的病毒示踪剂又可根据病毒的种类分为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等，适合作为表达外源基因的载体。逆转录病毒会将基因组整合进神经元细胞基因组，表达稳定长效；但是滴度与其他病毒相比略低。腺相关病毒滴度高、表达稳定长效、几乎无毒，且可以用同源重组进行编辑，是实验室广泛使用的一类；缺点是能够携带的外源基因较小，长度在4.8kb左右。腺病毒滴度高、感染迅速，也同样可以运用重组编辑；但病毒的衣壳蛋白会引起炎症反应。
能够跨突触的病毒示踪剂常使用的主要有两类，分别是疱疹病毒和弹状病毒。这类病毒因为保留了病毒的复制能力，相应地，其拥有快速的感染能力和不小的毒性。疱疹病毒最常用的是逆行示踪的伪狂犬病毒（PRV）的Bartha strain和顺行示踪的α-疱疹病毒HSV-1 strain H129。
传统示踪剂和普通的病毒示踪剂无法解决的一个问题是示踪剂无法特异性地选择指定神经元。于是人们在疱疹病毒示踪剂上首次使用了CRE-LoxP系统加以实现。2001年，DeFalco等利用了CRE-dependent PRV实现了选择性标记特异类型神经元的输入环路，使得病毒只能从指定神经元开始逆行示踪。但PRV的缺点在于，无法感染灵长类动物神经。于是人们采用弹状病毒来完成对灵长类动物的研究。弹状病毒主要有逆行示踪的狂犬病毒（RV）和顺行示踪的水泡型口炎病毒（VSV）两类。
普通跨突触病毒示踪剂用神经元细胞存活时间来判断级联关系，然而考虑到细胞的自身特性和病毒的剂量，且伴随着时间的流逝，神经通路的复杂性使得判断变得不够准确。Wickersham等利用RV疫苗株Sad B-19构建了能够实现跨单突触的示踪剂。该示踪剂同样用到了Cre-LoxP重组技术和AAV病毒载体等工具，为现代复杂神经环路示踪等神经科学研究奠定了基础。
► RV病毒跨单突触示踪技术设计草图
对病毒示踪剂的开发还远没有结束，未来的方向将聚焦于降低毒性、更多基因编辑和探寻多样性的实验物种材料入手。
神经科学工作者一直想要实现的目标是知道于某个特定的时刻、在某个特定的区域，大脑具体发生了什么。为了实现这一目标，神经示踪技术自然必不可少，但即便具有了发展较完备的各类神经示踪剂，以及病毒等可作用于活体的示踪技术，想要看穿大脑，仍存在一个重要的问题亟待解决：那就是我们观测的高等生物的脑组织是不透明的，正如我们平时吃的脑花，都是白乎乎的。
这意味着光信号难以在样本深处传入和传出。尤其是采用多聚甲醛固定的样品，即便使用先进的双光子显微镜，固定样品也只能成像到约300微米左右的深度[v]。面对难题，除了不断研发性能更加先进的显微成像技术外，科学家们给出的另一个解决办法是“把整个大脑变透明”，也即“透明脑技术”。
近年来研究者开发了数种透明脑技术，列举两例：一是日本理化学研究所发育生物学中心（RIKEN）研发的，利用一种果糖水溶液（SeeDB），浸泡已固定的脑组织或胚胎样本数日，研究人员便可以结合双光子显微镜，观测到小鼠脑结构固定标本毫米级的深度。
►透明脑，图自 RIKEN
这是因为样品的不透明性究其原因是由光吸收和光散射两部分造成，在成像哺乳动物样品时光的散射为主要不透明原因。而高浓度的蔗糖溶液此前已有被用来减轻脑和无脊椎动物的样品的光散射的案例，SeeDB更进一步，利用果糖水溶液更高的光学折射率（1.502 at 37 °C，86.7% wt/wt, ~130% wt/vol），此折射率接近白质中阻碍透光性的脂质，故使用SeeDB不仅使得脑白质的不透明能清除更为彻底，也避免了此前使用蔗糖溶液时会出现的样品收缩和耗时过长样品损坏等缺点。SeeDB可以做到保留锥体神经元、树突棘等精细结构。
另一个透明脑技术为斯坦福的CLARITY技术，他们的策略更加“简单粗暴”——研究人员选择直接用透明材料替换脂质来消除不透明性。他们使用丙烯胺单体溶液浸泡样品，直到丙烯胺单体完全浸润组织深处。然后稍稍加热到体温附近，使得单体发生聚合反应，构成的聚丙烯胺凝胶高分子网络能够有效支撑组织，此时使用去污剂等完全抽离细胞结构中原本的脂质，就得到了由透明的聚丙烯胺水凝胶支撑的脑组织样本，结合神经示踪技术即可获得脑组织深处的图像。
► 图自http://clarityresourcecenter.org
CLARITY除了可以用于神经组织外，也可以被扩展利用到其他需要实现透明化组织，已被实现的有肺(Joshi, 2015; Saboor, 2015)、肝(Font-Burgada,2015)甚至完整个体/胚胎 (Epp, 2015;Yang, 2014)。
基于观测技术的发展和观测数据的积累，科学家建立数据库以保存和交流这些观察到的数据和图像，一个著名的脑神经科学数据库是ALLEN BRAIN ATALS（阿兰脑图谱），ABA基于基因组学和神经解剖学数据，构建了小鼠和人的脑部基因表达地图，使得研究者能方便的利用已有的研究数据去定位某个神经元的投射位置和方向以及相应基因的表达情况。
纵观神经解剖学发展的历程，我们能看到伴随着时间轴并进的另外几条发展脉络：
一是观察的结果由粗糙到细致。卡哈尔的成果在百年前可谓是不可思议般的精妙；但百年之后的今日，即便不是专业研究者，也会认为卡哈尔时代的银染法所绘制的神经图案是较为粗糙的。给出这种评判的自信正是源于这百年间各类示踪技术的发展和成像手段的进步，使我们对结构的观察结果开始具有相当高度的要求。我们今日的扫描成像及重构技术已经可以精确地描述突触以及更小的神经细胞的次级结构，倘若再经百年，又会是何情形？
二是观察的范围从小到大。卡哈尔当时所能观察的样品大小为其银染范围所限，是局部而缺损的。如今的透明脑等技术的发展，使得我们能够对一个完整的组织样本甚至个体样本进行细致的观察，无疑使得神经形态学的研究更加具有整体性。而Allen脑图谱等数据库的建立，也使得各个局部的数据得到拼合，并能够结合遗传学等其他学科的研究内容。
三是观察的对象从死到活。神经科学不仅需要观察已有的神经形态，还需要观察动态的神经发育过程，这就需要能够在活体样本中工作的成像技术。得益于不断发展的各类示踪技术和显微成像手段，我们已经能够观察活体样本的神经发育过程。更一步的，将超微结构的成像做到动态化则是我们寄希望于不远未来能够实现的理想。
神经解剖学是观察和记录的学科，可以说是作为筑于其上的、对发育和功能的研究的根基；而再在其上，又会有基于神经科学的各项交叉学科，如认知科学、神经行为学、神经工程学以至心理学。
想要写作首先要会理解、想要理解首先要会阅读、而想要阅读我们需要能够看见，作为诸学科根基的神经解剖学所做的正是实现“看见”、“看清”这么简单却无比重要的目标。因为看见，所以向前——基础的进步抬升学科的前沿，前沿的突破又带来基础的发展，科学就是这样一种螺旋上升、永不停止的文明之阶。
制版编辑：常春藤丨
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