►图1，番茄品种有着大量的遗传多样性（图片来自www.fromfilmerstofarmers.com）

撰文 | 汪鸿儒（遗传学博士）

责编 | 陈晓雪

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对于CRISPR-Cas9基因编辑技术，人们一直有着两个最为重要的期待：在生命健康领域，帮助治疗疾病；在农业领域，用于育种。最近，美国冷泉港一实验室主导的一项研究（Rodriguez-Lealet al., 2017），为基于基因编辑的分子育种提供了一个令人振奋的解决方案。在这篇发表在《细胞》的文章中，研究人员通过对影响番茄果实大小、花序结构和生长习性三个性状的顺式调节元件的编辑，实现了对这些复杂数量性状的精细操控。并通过简单的遗传设计，在受体品种中迅速固定目标性状。这一研究不仅大大扩展了育种上可用的自然变异，也为解析基因调控变化和数量性状间复杂关系奠定了基础。鉴于新的方案很容易地在其他作物甚至动物中推广开来，在可预见的未来，一场农业育种和数量遗传学研究的革命即将爆发。

提高番茄的产量，有两个方向：让单个番茄长得更大，或者让一株番茄上挂更多果实。对于这两个特征，科学术语为性状，简单称之为果实大小和果实数目的性状。在自然界中，番茄存在着大量的遗传多样性，仅在世界蔬菜中心的资源库中，就收藏了7000多份不同的野生和栽培番茄品种（图1）。当然，我们关心的果实大小和果实数目两个性状，也会呈现出多样性（图2和图3）。育种学家们首先会对种质资源库进行筛选和鉴定，例如，寻找一个果实大的番茄品种，通过杂交，将果实大的性状引入到好吃的番茄品种，再通过选育，最终获得又好吃又大的番茄。

► 图2. 不同番茄品种在挂果数量性状上表现出很大的遗传变异 （Park et al. 2014）

遗憾的是，只有在最理想的状况下，上面的技术路线才会按照预期实现目标。大多情况下，总会有一些我们不喜欢的性状与果实大小性状相伴，如番茄变大了，但味道也变差了，或者新的番茄品种更容易生病了。育种学家想对原有好吃的番茄品种进行一次“干净的系统升级”，并非想象的那么简单！

遗传学研究发现，性状是由基因控制的。过去一百多年，分子遗传学家们一直试图弄清楚类似番茄果实大小这种性状是由哪些基因控制的，这些基因之间又是如何相互作用并影响到番茄风味的。弄清了这些，科学家们就可以从基因层面，把只影响果实大小的部分摘出来放到受体品种中，在品种改良时就可以实现“干净的升级”了！

经过不同领域分子遗传学家们的辛勤工作，生物性状分子基础及组织形式的神秘面纱已经揭开。人们发现，每个性状实际上都是由一个复杂的分子网络在调控，而网络上的每一个节点就是一个基因。番茄果实大小性状也不例外，它由一个复杂到令人头疼的分子网络调控着，风味性状也一样。糟糕的是，这两个网络是交织在一起的，并又联到控制其他性状的网络上，从而形成一个更大更复杂的网络。这是一个坏消息，因为如果破坏了果实大小分子网络上的一个基因，可能就会波及到调控果实风味的网络，影响口味。正所谓牵一发而动全身！但好消息是，科学家发现在这个巨大网络上，几乎每个节点基因上都设有各种“调节器”。有一类“调节器”，叫做顺式调节元件（cis-regulatory element），它们对网络节点实行着精细而又准确的微调。它们控制着基因表达量的大小和基因的剪接形式；也可以接收另一类关键调控子——转录因子（或者称作反式调节元件，trans-regulatory element）下达的指令，让基因在特定的时间、特定的组织并以特定的量表达。一个“调节器”，往往可以对应一个特异的表型，因而实现对性状的模块化管理。也就是说，顺式调节元件像一个个功能专一的零件，当你改变顺式调节元件的时候，可以实现只对一个性状的特异性的调节，而这个正是我们想要的！

分子育种家们非常青睐这些“调节器”，在不同品种番茄的基因组中，这些“调节器”的版本不同，会造成信号的强弱不同，最终映射到性状上，表现出来性状的多样性。以番茄的大小为例，它的一个调节器位于一个名叫fasciated基因的内含子上。在两个不同的番茄品种中，这一“调节器”的差异，就导致了fasciated基因表达量的不同，最终造成番茄果实大小的差异（图3）（Conget al., 2008）。对于好吃的番茄，我们对它基因组上的“调节器”做一下调换，就可以育出又好吃又大的番茄品种啦！

 ►图3. 不同番茄品种在果实大小性状上表现出的多样性，fasciated基因内含子区域的序列变异贡献了这一性状的差异（Conget al. 2008）

不过，目前的这套分子育种系统也有它的不足。第一，它依赖于自然界现有的调节元件的变异。在fasciated基因的例子中，我们幸运地在自然界发现了某一个版本的调节元件，正好可以“调制”出大个的番茄，如果自然界没有这一版本的调节元件呢？第二，要实现对基因组上一个零件的调换，一般采用的是杂交的方式，需要很多代，因此这个育种系统非常耗时。而冷泉港科学家采用CRISPR-Cas9“基因魔剪”技术，巧妙地破解了这两个难题，从而释放了这一育种系统的无穷潜力。

快速产生变异的一体化操作

冷泉港Lippman实验室的科学家首先瞄准lc和fasciated两个基因，它们分别控制着果实形状和大小这两个数量性状。针对它们的顺式调节元件区域，设计多个靶点，进行了定点编辑，产生了不同的DNA序列变异，也造成了不同的表型效果。为了在后代中获得更加多的新变异，研究者采用了一个非常聪明的设计：他们将第一步获得的严重功能缺失的番茄植株和正常的番茄杂交。如此，在它们的后代群体中，一方面它们携带了CRISPR/Cas9的转基因，另一方面携带了目标基因的杂合形式。通过后代的分离，就会快速产生大量的、一系列目标基因突变的植株，对应到表型，会有着连续型的变异，其中有一些变异是很微小的。在fasciated基因的例子中，他们鉴定了1000多个杂交后代，其中将近一半携带了CRISPR/Cas9的转基因，而携带转基因的植株中又有一半产生了表型的差异。通过PCR鉴定发现，这些植株的基因组在目标区域确有新DNA变异产生。最后，通过对这些含有变异的番茄进行自交，可以很快地固定新变异，并且去除CRISPR/Cas9转基因。另外一个基因控制开花时间和生长习性的基因SP，它在自然界的现有变异形式较少。研究者也采用类似的思路，对其顺式调节元件区域进行编辑，“生产”了一系列株型的变异，而其中不乏应用上优异的变异（图4），为育种创造了丰富的可用“零件”。

►图4. SP基因启动子区不同的等位变异产生一系列的植物株型的多样性（Rodriguez-Leal et al. 2017）

这一育种方案重要特点是，直接对受体品种中的目标基因（如控制番茄大小的基因）进行编辑，可以快速大量产生一系列变异，然后从后代中鉴定筛选出理想的株系。这是一套产生新变异、在目标品种中整合新变异的一体化操作，避免了从其他株系导入基因的耗时步骤，大大缩短了育种周期。

种质多样性有救了

“发掘自然界新变异，整合有利变异”是长达近万年作物驯化的主题，也是现代育种研究的主要思路，但它依赖于本物种现有的遗传多样性。而遗传多样性的基础——丰富的自然变异，是靠本物种的群体在长达数万甚至数百万年的时间里产生，并历经一系列群体事件，而最终保留至今。随着全球人口增长，人的生存空间和生态环境之间的冲突加剧，这些物种种群遭到破坏，多样性也会不断丢失。科学家们在全球建立了许多重要作物的种质资源库，大大延缓了全球物种多样性的丢失。但是，放在种子库中的种子，又失去了随着环境变化不断产生新变异的机会。

Lippman实验室的育种设计规避了这些问题，大大突破了“物种现有自然变异”的限制；另一方面，也避免了在自然变异的汪洋大海中寻找优异变异的操作，而是针对特异的基因组靶点，自行创造育种所需新变异。

突破“物种现有自然变异”限制，除了育种上的巨大价值，也为数量遗传学研究带来了前所未有的契机。自然界中现有基因变异，往往都是自然选择的结果，不适应环境的变异已经被剔除。实际上，那些“不适应”的变异，对于数量遗传学研究却是宝贵的材料。Lippman实验室的这一研究通过在顺式转录元件位置创造大量突变，从而制造出调控效果不同的等位变异，进而对数量性状的分子网络产生不同的调控作用，产生不同的表型。通过大量创造DNA变异以及对应不同表型这一对“输入”和“输出”，研究者可以系统评估顺式调节元件的功能，研究它们参与的分子模块以及时空组织形式。无疑，Lippman实验室的这一项开创性的工作，将帮助植物学家再次引领数量遗传学的研究。

参考文献：

Cong, B., Barrero, L.S., and Tanksley, S.D. (2008). Regulatory change inYABBY-like transcription factor led to evolution of extreme fruit size during tomato domestication. Nat Genet 40, 800-804.

Park, S.J., Jiang, K., Tal, L., Yichie, Y., Gar, O., Zamir, D., Eshed,Y., and Lippman, Z.B. (2014). Optimization of crop productivity in tomato using induced mutations in the florigen pathway. Nat Genet 46, 1337-1342.

Rodriguez-Leal, D., Lemmon, Z.H., Man, J., Bartlett, M.E., and Lippman,Z.B. (2017). Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing. Cell 171, 470-480 e478.