CRISPR大范围“脱靶”？可能还需要进一步验证
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编者按：
CRISPR基因编辑会导致数以百计意想不到的突变？5月30日，《自然-方法》刊登的一篇通信文章显示，来自美国哥伦比亚大学等研究机构的科学家确认通过CRISPR基因编辑技术成功修复了导致两只小鼠失明的基因后，经全基因组测序发现小鼠体内有超过1500个单核苷酸发生突变，并有百个以上的位点发生发生了大片段的缺失和插入。
文章作者认为，在CRISPR平台可以无风险地使用前，尤其是在临床环境中，可能还需要更多的工作来提高CRISPR/Cas9的精确度。他们建议，未来使用新的CRISPR方法和试剂应考虑使用全基因组测序来确认体内脱靶突变的存在。
在CRISPR技术更多地被用于人体临床试验之前，这一提醒值得关注。不过，这篇文章本身也引发了科学家们的讨论。中科院上海神经科学研究所研究员仇子龙评论说，这一研究发生大范围脱靶是“在制作完全性基因敲除小鼠时，在受精卵里注射了过多的Cas9 mRNA和sgRNA导致”，而将CRISPR作为临床治疗手段时则不会这么做。
中科院上海神经科学研究所研究员杨辉和他的博士研究生唐骋也向《知识分子》分享了他们的观点。他们认为，这篇通讯文章本身存在争议，但鉴于CRISPR如此受到广泛的关注，距离大规模应用如此之近，此时此刻，任何基于事实的质疑声音都有其价值。
撰文 | 唐骋、杨辉（中科院上海神经科学研究所）
责编 | 陈晓雪
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最近，国际著名期刊《自然》子刊《自然-方法》（Nature Methods）刊登了一篇颇具震撼的论文，其主旨大概就是说目前火热的基因编辑技术CRISPR/Cas9有可能导致一些不可预料的基因突变，也就是业内所说的“脱靶”（off target）现象[1]。
坦率地说，自从人类开始对基因实施编辑以来，脱靶就一直是一个困扰科学家的难题，而CRISPR/Cas9之所以能从众多基因编辑技术当中脱颖而出，原因之一就是其极低的脱靶概率[2, 3]。全球多个实验室将CRISPR/Cas9用于人类疾病的相关基因治疗研究，四川大学华西医院甚至在去年开始将CRISPR/Cas9基因编辑技术用于临床试验，尝试治疗晚期肺癌患者。这种时候，突然有研究表示CRISPR/Cas9其实依然有着非常高的脱靶率，甚至可以造成“一千多个”预测之外的基因突变，业内人士可以说是非常震惊。
那么，这篇论文说的是否有道理呢？
首先必须强调，《自然-方法》刊登的这篇文章不是架构严谨的学术论文，而只是一篇简短的“通信”（correspondence）。这个栏目与其说是正式发表某个科学结论，毋宁说是公开一种想法来让有条件的实验室去验证之。因此，文章本身的实验和数据也只是展现一种可能性，但并不足以支撑起一个科学结论所需的完整逻辑结构。
经和业内人士交流，我们认为文章主要存在以下几点争议：
一，文章总共涉及了三只小鼠：两只实验，一只对照。这个数量是严重不足的，因为你无法分清这个结果究竟只是这一两只动物的“个案”，还是某种普遍的规律，而只有大量的重复才能抹平一只只小鼠的“个性”，从中总结出最普适的结论。
动物数量和分组上的问题也连带导致其后期的数据处理有了诸多不合理之处。例如，文章将小鼠身上所有的单核苷酸变异（SNV）全都归咎于CRISPR/Cas9的脱靶。事实情况是，自然界一切生物无时不刻都在发生基因突变，即使是基因背景高度一致的实验室近交系小鼠，每个个体之间也依然有着大量的基因差异，而现有的数据库也不可能完全覆盖具体每一只小鼠的SNV。因此仅仅与数据库当中的“标准模型”或是一只对照组小鼠的基因相比对，并不能辨明那些SNV究竟是CRISPR/Cas9所为还是其本身就有的基因突变。对照实验应该分析实验小鼠的父系母系基因组，看看哪些突变是遗传的而不是Cas9基因编辑诱导的。
二，实验只基于一个sgRNA数据。SgRNA的功能是引导Cas9核酸酶作用于基因组的特定位点，然而该sgRNA特异性评分很低，造成许多脱靶效应也在预料之中。其他sgRNA是否也有类似结果并不清楚。
三，应该做一个只注射Cas9蛋白组或Cas9 mRNA组，看看该核酸酶本身是否能导致大量的SNV及DNA插入或缺失（indels）的情况。
四，文章中为了制取CRISPR/Cas9编辑的小鼠，采用了向受精卵当中共注Cas9蛋白以及sgRNA质粒的方法，而这实际上是一种比较“非主流”的设计，蛋白溶剂可能具有一定毒性，质粒表达缓慢且不易降解，可能会影响到整个系统的稳定性。现在比较主流的方案是向受精卵当中共注Cas9的mRNA与sgRNA。尽管我们不好说这种蛋白加质粒的设计会不会增加脱靶率，但是采用一种一般人不会用的实验方案就会让其说服力打一定的折扣。
五，对于indels和SNV的验证上，只显示了1个SNV的数据（可能因为版面原因），indels是否是真实的，在其他子代及父母中是否也存在，这些文中并没有说明。
然而，正如该文一开始所说，这只是一篇简短的阐述想法的通信，其初衷本就是引发讨论而非盖棺定论，在更多证据出来之前，我们既不能轻率地说CRISPR/Cas9有严重缺陷或是《自然-方法》登错了文章。毕竟科学的本质就在于不断地质疑与讨论，既然是质疑，自然就是有的质疑合理，而有的则不那么合理。
王尔德说过，比遭人议论更糟糕的是无人议论。把任何想法放到台面上来讨论正是科学不断进步的原动力。CRISPR/Cas9作为一种对人类未来命运休戚相关的重要生物技术，一些谨慎的声音总是很有意义的。从这个角度讲，《自然-方法》敢于刊登一些不同的声音，让大家可以换个角度看待问题，也对得起其作为一个国际著名期刊的责任吧。
参考文献：
1. Schaefer KA, Wu WH, Colgan DF, Tsang SH, Bassuk AG,Mahajan VB. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods 2017; 14:547-548.
2. IyerV, Shen B, Zhang W et al. Off-targetmutations are rare in Cas9-modified mice. NatMethods 2015; 12:479.
3. SmithC, Gore A, Yan W et al. Whole-genomesequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-basedgenome editing in human iPSCs. Cell StemCell 2014; 15:12-13.
