●             　●             　●

以CRISPR/Cas为代表的基因编辑技术近年来在基础研究和转化应用上突飞猛进，并作为2020年诺贝尔化学奖的表彰成果为公众所熟知而成功  “出圈”。

经典的基因编辑意在 “改写” 细胞基因组DNA序列，为保证 “改写” 效率需要 “剪断” 基因组（形成DNA单链缺口或双链断裂），这不仅会造成一定的细胞毒性，且部分 “改写” 结果是我们所不需要的副产物。

真核生物基因组DNA缠绕在组蛋白上形成名为核小体的结构，启动子区域往往富含大量的胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）（CpG双核苷酸），被称为CpG岛。在不改变DNA序列的前提下研究组蛋白和核苷酸上化学修饰对基因表达的作用是表观遗传学内容之一。而表观基因编辑技术是整个基因编辑领域的发展分支之一，即通过对目标DNA的CpG或周边组蛋白人为修饰化学基团（比如添加甲基）来改变基因表达，这个过程不需要对基因组进行 “剪断” 和序列 “改写”。这些化学基团即可以利用细胞本身的表观遗传机制在细胞增殖时维持稳定（表观记忆），也可以进一步修饰或被消除。由于编辑的最终目的是量化调节RNA或蛋白的表达水平，因此不会出现像DNA序列在 “改写” 时的随机副产物。

可见，表观基因编辑能在某些情境下弥补DNA编辑的不足。

2021年4月9日，由来自麻省理工白头研究所（Whitehead Institute）的乔纳森·维斯曼（Jonathan S. Weissman）教授与加利福尼亚大学旧金山分校的卢克·吉尔伯特（Luke A. Gilbert）副教授领导的研究团队在《细胞》（Cell）上发表了一种全新的表观基因编辑技术——CRISPRoff/on [1]。该技术能够在全基因组范围内高效地通过表观修饰影响细胞基因表达，该表观记忆可随数百次细胞分裂稳定遗传，并可人为主动逆转。

“这里最重要的是，我们现在有了一个可以沉默绝大多数基因的简单工具，” 维斯曼教授接受MIT媒体采访时表示 [2]，“我们可以同时对多个基因进行此操作，而不会造成任何DNA损伤。修饰结果具有很高的同质性，并且可以逆转。这是控制基因表达的绝佳工具。”

以往的表观基因编辑相关技术只在少数几个内源基因位点得到验证。此外，一些技术工具的设计和构成包含了两个或三个单体蛋白，这让多基因的表观编辑和实验优化变得十分不便。

其实早在2014年，同样是维斯曼与吉尔伯特课题组就利用了无核酸酶活性但保留DNA结合能力的dCas9蛋白（来自酿脓链球菌），结合转录抑制因子或激活因子，通过guide RNA介导特异性靶向定位，以持续性地表达实现对特定基因的持续性抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa），并在全基因组层面进行正向高通量筛选 [3]。可以说这项首次同时利用基因表达 “加” 和 “减” 进行筛选的突破性成果为他们后续的 “开” 与 “关” 表观基因编辑技术开发奠定了研究思路与工作基础。

在本研究中，作者将dCas9蛋白与从头甲基转移酶DNMT3A、调节蛋白DNMT3L、以及常用的转录抑制因子ZNF10 KRAB功能结构域组合成融合蛋白，并与guide RNA形成CRISPRoff复合体。相对的，作者将dCas9蛋白与羟甲基化酶TET1的功能结构域融合，附及一系列转录激活因子和guide RNA，构成CRISPRon。实验结果显示：CRISPRoff可以灵活且特异地同时靶向多个目的区域，造成CpG的甲基化与组蛋白H3K9的三甲基化，从而关闭基因表达。由于表观遗传的调控机制，CRISPRoff只需要一过性表达即可长期维持细胞的表观记忆。实验证明无论是在转染后15个月经过450次的细胞分裂，或是诱导性多能干细胞分化为神经元后，细胞的表观修饰都能够稳定维持。而CRISPRon可以高效逆转CRISPRoff造成的表观修饰并重新激活基因表达。

为深入探究CRISPRoff的特性，并将其开发为正向高通量筛选系统，作者在全基因组的范围内测试了CRISPRoff的靶向表观修饰能力，证实了该技术不仅可以沉默编码蛋白的基因，也能抑制多种多样的非编码RNA的基因，它可以沉默几乎所有基因的能力使其适用于表型-基因型的正向高通量筛选。

有趣地是，在这项全基因组范围的测试中出现了颇让人意外的结果，CRISPRoff甚至能够沉默那些在启动子区没有CpG岛的基因。吉尔伯特说到：“在这项工作之前，人们曾认为那些占比总基因数达30％的没有CpG岛的基因不受DNA甲基化的控制。但是我们的工作清楚地表明，没有CpG岛依然可以通过甲基化来关闭基因。这让我感到非常惊讶。” [2]

能够自由 “开/关” 的新型表观基因编辑技术CRISPRoff/on不仅能够大大促进功能基因组学的研究，其一过性表达即可长期改变表观修饰与结果同质性的特点使其非常适用于某些基因治疗方案，比如通过向患者体细胞导入编码CRISPRoff/on的信使RNA（比DNA载体更加安全），对显性失活等位基因、单倍剂量不足、印记障碍等状况进行适当的修饰和表达调整，从而治疗或缓解病症。