化学21 张锋、Jennifer 和Emmanuelle Charpentier：无限风光在险峰：张锋过关斩将共享诺贝尔化学奖-资讯-知识分子

化学21 张锋、Jennifer 和Emmanuelle Charpentier：无限风光在险峰：张锋过关斩将共享诺贝尔化学奖

2020/09/28

导读

Jennifer Doudna Emmanuelle Charpentier2019 - - 2019 Feng Zhang Jennifer DoudnaEmmanuelle CharpentierCRISPR-CAS92012Jennifer DoudnaEmmanuelle Charpentier1957 CRISPR-CAS9 CRISPR-Cas9 · Jennifer Dounda · Emmanuelle Charpentier · George Church · Virginij...

华人科学家张锋，与美国科学家Jennifer Doudna、法国科学家Emmanuelle Charpentier分享了2019年诺贝尔生理学或医学奖。

- 编者按 -

五分钟前，瑞典科学院宣布，2019年诺贝尔化学奖授予美国麻省理工学院张锋（Feng Zhang）、加州大学Jennifer Doudna和现在德国工作的法国科学家Emmanuelle Charpentier，表彰他们发明基因修饰方法CRISPR-CAS9。这一工作由来已久，最后技术突破是2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier。但在她们之前和之后，有多位科学家的贡献，所以一直不清楚她们之外，还有谁会与她们共享。张锋成为第二位获得诺贝尔化学奖的华人科学家，也是自从1957年杨振宁、李政道获得诺贝尔物理奖后第十位获得自然科学诺贝尔奖的华人。

《知识分子》曾撰文多次介绍CRISPR-CAS9及其相关工作和科学家。

● 　● 　●

如果基因编辑技术 CRISPR-Cas9 获得诺贝尔奖，没有任何悬念地，人们一致认为詹妮弗·杜德纳（Jennifer Dounda）和埃马纽尔·夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）会获奖，最大的悬念则是，第三人是谁？张锋、乔治·彻奇（George Church）、维吉尼亚斯·斯克斯尼斯（Virginijus Siksnys），还是欧洲的其他科学家？亦或者是并没有第三人？

法国科学家Emmanuelle Charpentier与美国科学家Jennifer Doudna

北京时间2019年10月9日下午5点45分，诺贝尔奖委员会做出了选择：加州大学伯克利分校教授詹妮弗·杜德纳、德国马普感染生物学研究所教授埃马纽尔·夏彭蒂耶和美国麻省理工学院教授张锋因 “对CRISPR-Cas9基因编辑技术的发明做出的关键贡献”/阐明CRISPR-Cas系统的基因组编辑机制获得2019年诺贝尔化学奖。

CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇规律间隔短回文重复序列）这一短语的首字母缩写，是基因组DNA上的一段特殊的序列，源于细菌及古细菌中一种获得性免疫系统，能够识别出入侵细菌的病毒，并通过一种特殊的酶破坏入侵的病毒。

实际上，人们第一次发现CRISPR序列是在1987年，由日本分子生物学家石野良纯（Yoshizumi Ishino）在大肠杆菌中偶然发现，但是第一次证明CRISPR/Cas9可以进行基因编辑，是美国分子生物学家杜德纳和瑞典于默奥微生物研究中心的法国微生物学家夏彭蒂耶在《科学》杂志发表的第一篇研究论文。在2012年6月发表的论文中，两位女性科学家带领的研究团队纯化了Cas9蛋白，发现它是双RNA引导的DNA内切酶，首次在体外证明使用Cas9的CRISPR系统可以切割任意DNA链，指出CRISPR在活细胞中修改基因的能力。这是最早发表的把细菌天然免疫系统演变成CRISPR/Cas9基因编辑工具的工作。

因为简单、廉价和高效，CRISPR已经成为全球最为流行的基因编辑技术，被称为编辑基因的“魔剪”。科学家通过它可以高效、精确地改变、编辑或替换植物、动物甚至是人类身上的基因，经过改造的CRISPR技术被广泛地应用于农业和生物医药领域。

CRISPR专利之争

最早证明CRISPR-Cas9可以编辑哺乳动物细胞基因的华人科学家张锋此次与两位女科学家共享诺奖，而另一位同样最早证明CRISPR-Cas9应用潜力哈佛大学医学院教授乔治·彻奇（George Church）则与诺贝尔奖失之交臂。

在此之前，1993年诺奖得主、麻省理工学院教授菲利普·夏普（Phillip Sharp）曾表示，基于CRISPR的基因编辑技术有四个关键的发现者：夏彭蒂耶、彻奇、杜德纳和张锋。所以，诺奖最多颁给三人的规则显然就是个问题。他认为，一个比较明智的决定可能是：诺贝尔化学奖颁给杜德纳和夏彭蒂耶，她们的工作是纯生化，生理或医学奖给彻奇和张锋，他们在活体细胞中成功应用CRISPR，为医学的应用铺平了道路。

2013年1月，张锋和彻奇同时在《科学》杂志分别发表论文，将CRISPR/Cas9基因编辑技术成功地运用到小鼠和人类细胞，实现了CRISPR在哺乳动物细胞的基因编辑。而在几周之后，杜德纳实验室也发表了类似的结果。

凭借证明自己的实验室在2011年就开始有了把Cas蛋白簇和tracrRNA放到哺乳动物细胞中的想法，并第一个证明CRISPR/Cas9整个概念，使CRISPR技术从最初的构想到在哺乳动物细胞成功应用的证据，张锋在2014年4月获得美国专利与商标局关于CRISPR的首个专利授权。

对于这一结果，更早提交专利申请的杜德纳和加州大学伯克利分校并不认可，并在2015年4月提交申诉材料。2016年1月，关于谁首先发明了CRISPR技术，加州大学伯克利分校和麻省理工学院-哈佛大学博德研究所展开交锋。杜德纳和加州大学伯克利分校认为，张锋只是杜德纳论文的诸多跟进者之一，将CRISPR运用到小鼠和人类细胞上只需要常规技术。但张锋一方的理由是：杜德纳只是预测CRISPR会在人类细胞上有效，自己是第一个将CRISPR运用到人类细胞中的人。随后，美国专利与商标局宣布正式启动干涉程序，将重新宣判CRISPR专利的归属问题。

2017年2月，三名专利法官组成的小组一致裁决，张锋等人2014年申请的专利“在事实上毫无争议”，与加州大学伯克利分校申请的专利并无冲突。根据这一裁定，杜德纳和加州大学伯克利分校覆盖关于CRISPR的所有专利，而张锋和博德研究所拥有其中的一项关键专利。

不过，加州大学伯克利分校在接受媒体采访时表示尊重专利法庭的裁决，但还是将会上诉至美国联邦巡回上诉法院。

2018年9月10日，美国联邦法院的裁决支持了专利上诉委员会2017年2月对基因编辑技术CRISPR专利的决定。专利上诉委员会认为，博德研究所拥有的CRISPR专利，并未侵犯伯克利以及维也纳大学的利益。

CRISPR基因编辑技术背后的科学家

事实上，CRISPR技术今天能够给整个科学界和农业、生物医药领域带来暴风骤雨般的变革，其发现离不开一大批科学家和博士研究生的贡献。

博德研究所所长埃里克·兰德（Eric Lander）曾经就CRISPR基因编辑技术的发明过程总结了一篇“CRISPR英雄谱”：

1993年，西班牙科学家弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica）首先在嗜盐古细菌（Haloferax mediterranei）的基因组中发现了大约30个碱基对（bp）长度的回文重复序列，这些序列由36bp的间隔序列隔开。

2005年，经过生物信息学序列比对方法，莫伊卡发现，CRISPR序列中三分之二的间隔序列为病毒或外源质粒的序列，他意识到CRISPR系统与细菌的获得性免疫有关。

与此同时，法国科学家吉利斯·维格诺德（Gilles Vergnaud）和俄国科学家亚历山大·博洛廷（Alexander Bolotin）在2005年分别独立得到与莫伊卡类似的结论，即CRISPR与细菌的获得性免疫有关。

2007年，法国分子生物学家、杜邦公司职员菲利普·霍瓦特（Philippe Horvath）和他的同事鲁道夫·巴兰右（Rodolphe Barrangou）以及微生物学家Sylvain Moineau在研究生产酸奶的乳酸杆菌对噬菌体的抗性时，发现了Cas7和 Cas9蛋白在CRISPR中的作用：Cas7产生间隔和重复序列，Cas9则是核酸酶。

2008年8月，荷兰科学家范德欧斯特（John van der Oost）通过生物化学方法鉴定了一系列Cas蛋白，并发现这些蛋白需要切割一段长为61碱基的前体RNA（crRNA）才能工作。他们证明了crRNA的作用，并通过人为设计相应的crRNA序列使菌株获得了抵抗噬菌体的特性。这是人类首次编辑CRISPR系统。

2008年12月，阿根廷科学家卢西亚诺·马拉夫尼（Luciano Marraffini）和他的导师埃里克·松特海姆（Erik Sontheimer）证实了CRISPR系统的底物是DNA，并且意识到该系统可能可用于DNA编辑。

2010年12月，西尔万·莫伊诺（Sylvain Moineau）证实了核酸酶Cas9可以在crRNA的指导下对特定序列的DNA进行切割。

2011年7月，立陶宛科学家维吉尼亚斯·斯克斯尼斯（Virginijus Siksnys）在大肠杆菌中重组了嗜热链球菌的CRISPR系统，证实了该系统至少需要Cas9核酸酶，crRNA和tracrRNA三个组分，这一结果2012年9月发表于《美国国家科学院刊》（PNAS）。

2012年8月，杜德纳和夏彭蒂耶发表关键性的实验，揭示CRISRP/Cas9技术可以实现基因编辑的分子机制。

不过，兰德的这篇文章被认为将荣誉归实验室的领导者，而忽视了博士后和研究生的贡献。

《自然》新闻曾经写过一篇文章，详细介绍了在开发CRISPR/Cas9技术的过程中，杜德纳实验室的博士后布莱克·威登赫夫特（Blake Wiedenheft）和马丁·伊内克（Martin Jinek），张锋实验室的丛乐，彻奇实验室的博士研究生杨璐菡，立陶宛维尔纽斯大学维吉尼亚斯·斯克斯尼斯团队的博士研究生基迪斯·加西乌纳斯（Giedrius Gasiunas）等做出的贡献。

那些年，CRISPR研究带来的荣誉

“近期很少有一个发现能够像CRISPR在生物领域一样，改变整个领域的研究。它在人类健康与疾病等方面有极大的应用潜力。”今年8月，美国阿尔伯尼生物医学奖委员会主席Vincent Verdile博士曾这样说。

实际上，在诺贝尔奖颁给CRISPR之前，CRISPR早已得到众多奖项的认可，为相关的研究者带来大量的荣誉。

2014年，杜德纳与夏彭蒂耶共同分享了2015年生命科学突破奖，每人获得300万美元的奖金。

2015年，杜德纳与夏彭蒂耶获得西班牙的阿斯图里亚斯女亲王奖（Premios Princesa de Asturias）中的科学技术奖项。

2016年3月9日，杜德纳、夏彭蒂耶、鲁道夫·巴兰右、菲利普·霍瓦特和维吉尼亚斯·斯克斯尼斯因在理解CRISPR的细菌防御系统及其在基因编辑方面的革命性发现做出杰出贡献获得2016年度阿尔珀特奖。

2016年3月23日，杜德纳、夏彭蒂耶与张锋“因将基因编辑技术CRISPR-Cas应用于真核细胞所作出的努力”获得有“小诺贝尔奖”之称的加拿大盖尔德纳国际奖（Gairdner International Award）。

2016年6月19日，台湾唐奖的生技医药奖再次颁给以上三人，以表彰他们为“发展CRISPR-Cas9系统成为突破性的基因编辑平台”做出的贡献。

2017年2月2日，杜德纳与夏彭蒂耶获得2017年日本奖（Japan Prize），每人获得5000万日元（约42万美元）的奖金。

2018年5月31日，杜德纳、夏彭蒂耶和斯克斯尼斯获得卡弗里纳米科学奖。

杜德纳回顾如何发现CRISPR/Cas9实现基因编辑：

在与夏彭蒂耶、张锋一起获颁台湾唐奖的一个报告中，杜德纳回顾了她和夏彭蒂耶是如何发现CRISPR/Cas9可以实现基因编辑的。

我们和夏彭蒂耶合作，用生物化学方法纯化了 Cas9 蛋白，发现它是双 RNA 引导的 DNA 内切酶，意思是这个蛋白能够和两条不同的 RNA 结合。一条是包含引导序列的 crRNA，能和DNA进行碱基配对。

在合作的过程中我们发现，另一条 tracrRNA 对于 crRNA 的加工处理很重要，对于寻找目标 DNA 的能力也是必要的，所以这是一个两条 RNA 的系统在和蛋白交互作用，形成进行监控的复合体。这个蛋白的运作方式是靠两把化学剪刀，在目标区域将 DNA 旋开后进行切割。重要的是，要切割的目标位置，必须是在 DNA 上的 PAM 模体旁边。

在了解运作的机制之后，我们意识到其实可以把系统进一步简化，弄得比自然界更为简单。我们将两条 RNA 合而为一，形成单链引导型态：一端包含需要搜寻的目标序列，另一段是和 Cas9 结合所需要的资讯。如此简化成双分子系统，一个蛋白被一条 RNA 引导至 DNA 序列，制造DNA 的双股断裂。

如果要锁定新的目标，只要变更RNA 这一小段序列，任何分生学家都可以轻易在实验室内办到。我们为此感到很兴奋，因为我们了解到这显然是可以程式化的蛋白。设定指令即可导向不同的DNA序列，进行双股切割。