弄清病毒“身份证”

这些技术难关是如何突破的呢？在回答这个问题前，首先需要科普一下核酸检测到底是什么，以及为什么它能准确地检出新冠病毒。

核酸是核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的总称，也就是我们常说的RNA和DNA，是生物体遗传信息的总和。核酸就好比一张设计图纸，没有它就永远盖不好一座大楼。

现在常用的检测方式如荧光PCR法（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应），便是利用PCR可以在生物体外扩增特定的DNA片段，从而达到检测的目的。

换句话说，待测样品（疑似病人试样）就好比一个陌生人，我们不知道他是谁，但他有一张独一无二的“身份证”——目标DNA。我们利用PCR法不但可以看到他的“身份证”，还可以扩增复制很多张，从而利用荧光检测来确定他到底是谁！

这个过程说来简单，但实际操作并不容易。

核酸检测并不像曼妥思糖丢入汽水时瞬间剧烈反应，也不像硫酸铜滴入氢氧化钠会出现明显的阳性反应，所以以往的核酸检测往往需要在严苛的实验环境条件和专业的设备下，经过2-3小时的繁琐操作和反应才能得到检测结果。而且，在取样过程中非常容易受到杂质的影响，从而导致核酸提取的损失，受实验条件的影响还会导致样本扩增倍率低，最终经常导致“假阴性”情况出现。

刘鹏（左）、白净卫（中）、李寅青（右）

而清华大学刘鹏、白净卫、李寅青团队，正是克服了以往核酸检测对时间、条件和灵敏度的苛刻要求，实现了从咽拭子取样、一体化卡盒反应、胶体金试读取的自助操作，在保证准确率的前提下，30分钟内即可出结果！

把耐力跑变成接力跑

“时间提速是我们这次做核酸检测要解决的最大难题！”白净卫此前长期从事基因测序技术的研究，积累了丰富的核酸样本采集、处理、检测的经验。他介绍，核酸检测PCR法利用传统的方式让样品扩增，一开始样品复制很快，但后期速度就递减，耗时太长。

“我们在技术攻关中，采用了巢式等温扩增（ITA）技术。”白净卫表示。所谓的“巢式”，可以理解为 “嵌套”，一个环节嵌套一个环节。白净卫把新冠检测这类恒量核酸样本的扩增的过程比喻为“运动员长跑”，运动员一开始速度很快，但是往往耐力不足。样品扩增也是如此，一开始复制很快，但中途就衰减下来，所以为了提高速度，他们把“长跑”改成 “接力跑”，可以在短时间内完成对个位数的新冠病毒进行检测。

“最后，以上反应物在胶体金试纸上通过竞争法显色，读取方式与验孕棒类似，一目了然。” 白净卫说，整个过程理论上22分钟即可完成，检测者个人操作的话，30分钟之内完全可以实现“样本入，结果出”。

时间允许条件下样本准确率近100%

药学院李寅青长期从事 CRISPR 技术和微量核酸处理技术的研发，积累了丰富的样本处理、核酸扩增和检测经验。在核心检测技术研发上，他与白净卫紧密配合。

为了克服传统检测方法出现“假阴性高”问题，李寅青表示，他们在样本获取、核酸扩增、病原识别、胶体金免疫层析显色等环节，都进行了整合简化，减少检验人员的干预，提升检测的灵敏度。

共同探讨研究思路

“比如在简化样本处理方面，由于咽拭子样本通常含有抑制反应的杂质，常规检测样本通常需要经过核酸提取过程，这个流程费时且人工操作相对复杂，不适合未经培训的人员使用。”李寅青说，他们通过优化裂解流程和后端扩增试剂，实现不经过核酸提取直接进入反转录等温扩增的流程，极大的降低检测过程复杂性，减少了因杂质导致的“假阴性”案例。

李寅青介绍，他们用新研发的技术对19 例 QPCR（传统的实时荧光定量PCR方法）阳性患者样本进行了复合，结果全部可以检出。

“结果证明了本项目的灵敏度接近QPCR的灵敏程度，QPCR是300 拷贝/毫升（copies/ml），我们的灵敏度小于400拷贝/毫升。此外，与近期于国际顶级期刊 Nature Biotechnology 报道的美国加州基于CRISPR原理开发的高灵敏度技术相比，本项目独创的带标签的巢式等温扩增技术检测时间更短灵敏度更高。”李寅青表示。

一推一拉出结果！

如果说白净卫与李寅青主要的工作是开发检测软件，那么医学院刘鹏所承担的任务就是研发硬件——“检测盒”。

刘鹏在医学院生医系一直从事微流控与生物芯片方面的研究工作。“这个项目最初的想法就是实现居家使用，形状要便携，性能要集成。药学院项目组前期开发的检测试剂灵敏度高，速度快，受杂质干扰小，恒温检测对温控要求低，这些都为卡盒一体化集成提供了有利前提。”他提到“集成”的概念，“把检测环节都集中一个卡盒上，通过精密的流体控制，达到高灵敏度的检测效果。”

刘鹏介绍，以上操作和试剂将由“一体集成化微流控卡盒”承载：第一步，移动杆带动注射器式的活塞导致裂解的样品流入第一个等温扩增腔；第二步，反应10 分钟后，反应产物被稀释；第三步，泵入第二个等温反应室进行带探针的进一步扩增；最后，将反应混合物泵入装有层流试纸条的室中，以读出测试结果。这其中，卡盒含有 USB 或电池供电的简易恒温电路，可以提供扩增反应所需要的温度。

由美术学院赵超教授完成的卡盒外观设计成品

“为提高卡盒的用户使用体验，我们邀请了美术学院副院长赵超教授对卡盒进行结构和外观设计，赵老师从用户操作和体验等多个角度对卡盒的定型提供了非常大的帮助，预计未来的卡盒长宽高约为10x10x3cm，检测者使用时只要把两个推杆上下各一推，30分钟内就可以查看结果，操作非常简单。” 刘鹏表示，根据他们的设想，未来还将进行批量化检测卡盒研发，进行多样本检测，并将开发移动端 APP，辅助用户使用和结果判读。

据悉，下一步，该项目团队将推进小批量卡盒装配，验证批量化生产的可行性，同时与医院合作，加快临床样本的验证。目前，团队也正在积极寻找未来的合作伙伴，加快检测卡盒的报批工作。

没有想太多，只想做点事

刘鹏、白净卫、李寅青，三人在清华的经历非常相似，都是70后或80后，都有留美科研经历，科研兴趣相近，平时交流很多。

今年春节，“武汉封城”的消息让三人坐立不安。当时，他们不约而同搜索了领域内的相关论文并咨询了战斗在抗疫一线的医护工作者，发现核酸检测领域缺少这种能实现一体化、自助操作、高灵敏度的检测技术。在交流中一拍即合！他们立即决定开展研发，希望新产品无需任何仪器设备或操作员培训，即可作为门诊、现场或家庭自助式病毒检测手段。

说干就干！大年初四，三人在李寅青家里集合一起讨论。习惯了平时讨论把思路写在展板上的仨人，把李寅青家的客厅当成了实验室，用孩子的彩笔把思路写在了墙上。

写在墙上的研发思路

“之后，我们基本是按照当时的思路一步步的实现。” 李寅青说，从2月的思路规划、设计胶囊卡盒，到3月的Nest ITA和3D微流控，到4月的临床样本、卡盒集成，一步接一步。面对疫情，谁也不敢松懈，刚开始因为疫情影响，主要工作都是三个人亲力亲为，后来陆续有年轻的研究生们放弃寒假休息主动加入，丁胜老师让出了自己的细胞间，鲁白老师派学生前来充实人手，程京老师给予很多指导意见，期间也获得了很多热心抗疫的企业帮助和奋斗在抗疫一线的医务专家的指导，现如今，他们已经把5月、6月甚至到今年年底的攻关计划安排好，逐步推进。

正如刘鹏、白净卫、李寅青在采访中所说：“疫情当前，作为年轻的科研人员，真的没有想太多，轻装上阵，只想切切实实地为疫情防控能做点儿事！”