►图源：Pixabay.com

导读：

      2018年3月29日和4月2日，Cell和Nature Genetics杂志相继在线发表了来自波士顿儿童医院和澳大利亚新南威尔士大学的两项研究，揭示了胎儿血红蛋白在珠蛋白转换过程中被关闭的机理，回答了困扰领域数十年的谜题。下文中，Cell论文第一作者刘楠讲述了珠蛋白转换研究领域数十年间的曲折故事，为我们揭示了坚守在这个古老领域的科学家们是如何攻克一个又一个谜题，为相关疾病治疗带来曙光的。

 

撰文 | 刘楠（波士顿儿童医院/哈佛医学院博士后）

责编 | 李娟

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1962年，诺贝尔生理与医学奖颁发给了大众所熟知的划时代工作：生命遗传物质DNA双螺旋结构的发现。这项工作使人类认识到了生物大分子之美：由仅仅四种核苷酸作为重复单元，螺旋堆积而成的美丽纤维，却蕴含了足以创造生命的信息。

同年的诺贝尔化学奖，则颁发给了另一项结构生物学工作，生命活动的执行者——蛋白质的分子结构。这是人类第一次从接近原子水平看到蛋白质的庐山真面目，从而得以从另一个角度认识生命之美：以23种结构性质各异的氨基酸作为原料，按照一定的顺序连接成一条纤维，折叠出复杂的三维结构；无数种不同的组合以这种方式造就了繁多的精巧高效的分子机器。

►图片展示了人成体血红蛋白通过血红素结合氧气分子后的构象变化。来源http://pdb101.rcsb.org

这个开天辟地以来第一个被人类窥视到真容、并帮助Max Perutz斩获诺贝尔奖的蛋白质分子，叫做血红蛋白。

血红蛋白由α样珠蛋白、β样珠蛋白和血红素组成，大量存在于人体的红细胞中，负责为器官运送氧气以及交换二氧化碳（下文中珠蛋白、血红蛋白通用，不再区分）。提到这些名称生物医学背景的人都会想起教科书中的经典名词和图片，比如血红蛋白的晶体结构、血红蛋白和氧气的结合曲线、珠蛋白转换、珠蛋白基因座控制区和镰刀型贫血等等。

的确，血红蛋白易获取，具有奇特有趣的性质，成为了早期结构生物学和生物化学研究的最爱之一。而β珠蛋白基因座（包含珠蛋白基因和其控制区的约10万碱基对的DNA区域）也由于较早被克隆，成为了基因表达调控研究的模本。因此，珠蛋白和其基因座贡献了数不清的（考试重点）生物化学和基因表达调控的原理。

下面按时间顺序仅仅列出比较重要的几点贡献：

1949年，Linus Pauling发现镰刀型贫血是由β珠蛋白突变造成的“分子疾病”（Pauling and Itano, 1949）。他发现镰刀型贫血病人的β珠蛋白的第六位氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸。这个突变会导致β珠蛋白在红细胞内聚集沉淀，使红细胞变成镰刀状而失去正常功能。在分子生物学时代之前，Linus Pauling就第一次将疾病和生物大分子的序列改变联系在一起，可以说是前无古人了。

1962年，Max Perutz对血红蛋白结构的解析，使人们认识了最基本的蛋白质二维和三维结构单元，发现了配体结合可以改变蛋白质的三维构象，称为别构效应。

1963年，Linus Pauling通过测定不同物种的血红蛋白序列（当时DNA测序技术依然没有出现），发现了氨基酸序列的差别可以反映出物种亲缘关系的远近，由此构建了最早的分子进化树（Pauling and Zuckerkandl, 1963）。

70年代末，科学家发现有些基因的编码区域并不是连续的，而是被一些额外的DNA序列隔开，并相继在腺病毒外壳蛋白、β珠蛋白、卵清蛋白基因中报道了这种现象。现在我们将基因编码区称为外显子，中间的非编码区域称为内含子。最早发现这个现象的科学家Richard Roberts和Philip Sharp因此获得1993年诺贝尔生理与医学奖。

后基因组时代，科学家发现虽然DNA序列是一维的，但是DNA在细胞中是高度组织化和结构化的。其中一种重要的结构就是，距离基因很远的调控区域经弯曲之后与基因本身接触，形成DNA环，而这种高维结构对于基因表达的调控具有至关重要的作用。2002年，这种现象在第一次被实验验证就是以β珠蛋白基因座为例（Carter et al.,2002; Tolhuis et al., 2002）。现在，染色质的高维结构已经成为一个新兴的蓬勃发展的领域。

2017年，《自然》杂志的一则新闻统计了过去40年被研究最多的基因，β珠蛋白基因（HBB）在80年代前期当仁不让地稳坐天王巨星之位；80年代后期则慢慢被CD4、p53等“80、90后小鲜肉”取代。曾经在这个领域叱咤风云的科学家，很多也已经进入古稀耄耋之年。像这样一个人老“珠”黄的古老领域，很多知识都已经进入教科书，又会有什么令人激动的新发现呢？

前文提到，早在前基因组时代，珠蛋白基因的克隆，珠蛋白增强子的发现，以及相关疾病和突变的鉴定，就如火如荼的进行并完成了大半。然而这个领域却有一个长期困扰：所有的这些研究，并没有为治疗遗传性β血红蛋白疾病提供有用的线索。其中最常见的两种是镰刀型贫血和β地中海贫血。

镰刀型贫血的病因是β珠蛋白第六位氨基酸突变导致其自身聚合沉淀，扰乱了红细胞的正常功能，该突变在全世界有数百万携带者。

►镰刀型贫血患者的镰刀状红细胞会造成血管堵塞。图片来源：childrenshospital.org

β地中海贫血则是由多种其他突变破坏基因控制元件导致的，最终都造成β珠蛋白基因本身无法顺利表达，这些突变存在于全世界多达7%的人群中。虽然人们清楚的知道疾病的基因突变以及分子机理，已有知识却无法对疾病的治疗起到直接帮助。这个领域的领军人物Stuart Orkin曾说：“整个领域就像在沙漠中行走，找不到前进的方向”。

随技术的进步和不懈的坚持，科学家终于为这两种疾病的治疗带来了曙光。接下来，我将讲述三个横跨30多年的激动人心的故事。

在人们研究镰刀型贫血和地中海贫血的同时，另外一种遗传疾病和相关突变也引起了人们注意。这种疾病叫做“遗传性胎儿血红蛋白持续存在症”（后文简称“胎儿血红蛋白持续症”）。由于是遗传疾病，基本可以确定也是DNA突变造成的。这类人群没有完成正常的珠蛋白转换，血液中仍然含有一定比例的胎儿血红蛋白。

►人发育过程中的两次珠蛋白转换。图片修改自Bauer et al., 2012

胎儿血红蛋白具有较强的氧气携带能力，可以在母体血液中夺取氧气。正常情况下，漫长的进化却选择了一套复杂的系统来关闭胎儿血红蛋白，代之以携氧略弱的成体血红蛋白。毕竟，如果一个成年母亲血液中都是携氧更强的胎儿血红蛋白，她孕育的胎儿怎么获取足够的氧气呢？再者，如果血红蛋白和氧气总是依依不舍，那么机体如何应对需要大量氧气的紧急情况呢？因此某项功能并非越强越好，还需要有足够的弹性，才能应对复杂多变的生存环境，赢得生存竞争以繁衍生息。

“胎儿血红蛋白持续症”严格来讲并非疾病，因为这类人群的健康并没有受其影响。这种并无大碍的症状让当时的人们欣喜若狂：如果可以唤醒贫血病人体内的胎儿血红蛋白，替换或补充缺陷或缺失的成体血红蛋白，那么两种贫血疾病就可以被治愈了！

有意思的是，大自然慷慨地帮人类进行了“临床实验”。事实上，的确有这么一些人，同时患有贫血和胎儿血红蛋白持续症，他们的贫血症状得到了极大的缓解。比如，在地中海区域的希腊人群中，有很多“胎儿血红蛋白持续症”，正是被进化选择出来对抗β地中海贫血的机制。这么看来，该症拯救了贫血病人的生命，简直可以称得上是X战警突变了。

更有意思的是，在非洲、西亚等疟疾盛行的区域，大反派镰刀型贫血和β地中海贫血反而成了英雄，因为携带杂合突变的红细胞无法成为疟原虫寄生的宿主，这些人反而更能在疟疾盛行的区域生存下来。天使还是魔鬼？环境不同，结果相反。

回到正题，想利用唤醒胎儿血红蛋白的方法来治疗贫血，那么先要明白是什么关闭了胎儿血红蛋白基因的表达。要达到操纵基因表达的目的，需要先了解其原理，这就是基础科学研究的重要之处。于是，人们着手研究“胎儿血红蛋白持续症”人群携带的哪些突变导致胎儿血红蛋白无法正常关闭。

上世纪80年代，分子生物学技术已经开始登上历史舞台。Francis Collins，人类基因组计划的先驱之一，彼时在耶鲁大学做研究员（fellow）。

►Francis Collins。图片来源cure4kids.org

Francis  Collins掌握了当时最先进的分子克隆和DNA测序技术，达到了现在本科生的水平。1985年，他和另外一个研究组同时在《自然》杂志发表研究，鉴定了希腊人群中“胎儿血红蛋白持续症”的一个常见突变位点，称为“希腊型突变”（Collins et al., 1985; Gelinas et al., 1985）。

这个突变坐落在胎儿珠蛋白的启动子区，距离胎儿珠蛋白基因的起始位置仅117碱基，称为-117位点。在30亿碱基中，仅仅这一个突变就足以引起疾病。至今，人们在珠蛋白基因座又找到了数十种不同的突变，它们都可以引发“胎儿血红蛋白持续症”。

人们顺理成章地意识到这些位置（包括-117位点）应该是控制胎儿血红蛋白的“负开关”，意味着红细胞中应该有未知的抑制因子，会通过结合这些负开关来关闭胎儿珠蛋白基因的表达。1988年及其后数年，Francis  Collins和多个其他团队证实，红细胞的细胞核中的确存在一个这样的因子，可以结合在-117位置，而在希腊型突变中由于负开关被破坏，这个因子则无法与之结合。

因此，一个美好的设想由此开始：找到这个抑制因子的真实身份，开发药物打击这个抑制因子，唤醒胎儿血红蛋白，治愈镰刀型贫血和地中海贫血！利用大自然已经测试好的方案，使用自身已有的蛋白来治愈疾病，一切看起来多么完美，人们似乎终于走出了沙漠，来到了绿洲。

可惜，事情并未如愿。相反，这条线索自此没有了任何实质性的进展，这个神秘抑制因子的身份一直没有被发现。至于Francis Collins则熟练运用自己的特长，乘着分子生物学时代的春风发现了许多重大疾病的基因突变，包括囊性纤维化、亨廷顿病等，江湖人称“基因猎手”，后来接替詹姆斯·沃森领导了人类基因组计划。而人类基因组计划的成功，为第二个故事奠定了重要的基础。

时间来到了2008年。

故事的主角是波士顿儿童医院、哈佛医学院的Stuart Orkin。Orkin向来对新技术有很强的嗅觉。在分子生物学兴起的时代，他参与了珠蛋白基因的克隆，鉴定了多个导致地中海贫血的突变。在珠蛋白研究遭遇瓶颈的的二三十年里，他在血液发育和疾病领域继续做出重要贡献：80年代，他鉴定了多种血液疾病的DNA突变，其中包括腺苷酸脱氨酶缺乏症的致病突变（腺苷酸脱氨酶缺乏症是最早被基因治疗的遗传病）。1986年，他和同在波士顿儿童医院的Louis Kunkel合作，第一次通过图位克隆找到了遗传疾病的致病基因（Royer-Pokora et al., 1986）；90年代，他发现了决定血液红系发育命运的转录因子GATA1（Tsai etal., 1989），绘制了红系发育的蓝图。

进入基因组时代后，Orkin和其他科学家们都意识到，过去几十年人们通过游击战找到的致病突变，事实上可以交给电脑解决了。通过测定大量正常人群和患病人群的基因组，进行序列对比，找到患病人群特有的突变，也就找到了致病基因了。这就是全基因组关联分析。如果说此前Collins的研究是在小河里钓鱼，那么全基因组关联分析则是在大海里撒网捕鱼。

然而，尽管全基因组关联分析如雨后春笋般涌现，并找到了大量和遗传疾病相关的DNA突变，可是仅仅有极少的例子帮助人们定位了致病的基因。因为人们发现，绝大部分关联分析得到的突变根本就没有发生在基因内部。这种花费大量资金却无法给出明确答案的研究，一时受到大量的质疑。

现在，人们知道很多导致疾病的突变发生在基因表达的调控元件，如增强子中。增强子是一种控制基因表达与否的开关，和前文提到的近邻基因的启动子不同，它们往往远离其控制的基因，坐落于编码框之外，很难确定某个增强子在控制哪个或哪些基因。

如今，关于增强子的研究是重要的热门领域。人们认为人类基因组中增强子的数目多达基因本身的30倍，意味着平均每个基因有30个开关，每个开关在不同发育时段、不同组织、不同环境中，由不同的因素来控制。这些增强子和基因一起塑造了人体内数百种形态功能各异的细胞，不要忘了这些细胞都携带同样的遗传信息！

►人体中存在至少200种功能形态各异的细胞。图片来源dreamstime.com

如此复杂而精密的系统令人叹为观止，对生命心生敬畏。而谁能相信这些重要的非编码DNA序列，10多年前还被人们认为是“垃圾DNA”呢？而科学不断推翻自己，将人们带入未知的疆域，也正是其魅力所在。

20年来，Stuart Orkin并没有忘记内心的疑问：究竟是什么因子负责关闭胎儿血红蛋白呢？他和合作者决定使用全基因组关联分析来寻找答案。理论上讲，他们应该找到控制胎儿血红蛋白的两种元件：基因的负开关和控制负开关的抑制因子。因为这两种元件需要协同作用才能关闭胎儿血红蛋白基因，任何一个产生突变都会导致“胎儿血红蛋白持续症”。备受质疑的全基因组关联分析是否能帮助他们找到答案？

值得高兴的是，好运最终还是眷顾了执著的人。

2008年，他和合作伙伴针对胎儿血红蛋白持续症人群完成了关联分析（Uda etal., 2008）。结果让他们激动不已，首先，他们找到了胎儿珠蛋白的负开关，包括了过去几十年人们已经鉴定到的、位于珠蛋白基因座的已知突变，证明了全基因组关联分析可以找到已知的正确信息。

重要的是，他们还找到了另一群突变，位于一个看似毫不相关的基因BCL11A的非编码内含子中，而这个基因很可能就是抑制因子。说他们好运，是因为后续研究证明，这群突变所发生的位置，恰好是控制BCL11A的一个增强子。而且这个增强子没有远在千里，而是正好在它所控制的BCL11A基因的内含子中，可以说一箭射中了靶心！

►全基因组关联分析的曼哈顿图。上图来源wikimedia, 下图来源于Bauer et al., 2012

发生突变的增强子是BCL11A的正开关，在成体红细胞中会被激活因子控制并激活。有意思的是，这个激活因子，正是Stuart Orkin在90年代初发现的红系转录因子GATA1。那么问题来了，如果其他细胞，比如淋巴细胞也需要激活BCL11A，却没有GATA1红系激活因子，那么怎么办呢？

如上文提到的增强子模型所述，平均每个基因平均有30多个增强子，不同的增强子会响应不同细胞中特异的激活因子，因此，淋巴细胞可以使用它独特的激活因子-增强子组合来激活BCL11A。而有些细胞并不需要BCL11A，那么大自然就不会给BCL11A安装相应的增强子来响应激活因子。

让事情更加复杂而有趣的是，胎儿的红细胞也有GATA1，但它不希望激活BCL11A（下文会解释原因），怎么办呢？事实上，增强子一般需要多种激活因子合力发挥作用，BCL11A的增强子也一样，除了GATA1，还需要其他激活因子，这个因子只存在于成体红细胞，而不存在于胎儿红细胞中。

这个例子为上文提到的增强子模型提供了完美范例：通过每种细胞中激活因子-增强子的独特组合，人体得以在空间和时间上精确控制基因表达。因此，人体每种不同的细胞才具有了各自独特的基因表达谱，拥有各自独特功能，大脑才能成为大脑而不是肌肉或骨骼。

回到正题，Orkin团队通过一系列的实验证明，BCL11A确实是胎儿血红蛋白的抑制因子，在成体红细胞中将BCL11A删除后，胎儿血红蛋白会被唤醒；而胎儿的红细胞则没有BCL11A这个抑制因子的身影，因为它们本身就需要维持高水平的胎儿血红蛋白。这个发现终于填补了珠蛋白转换的最重要一环：是什么因子关闭了胎儿血红蛋白，成体红细胞如何实现珠蛋白转换？这一系列的工作也验证了BCL11A可以作为潜在药物靶点：靶向破坏BCL11A功能，唤醒胎儿血红蛋白，治愈镰刀型贫血或者β地中海贫血。

回头看早在2008年之前，就有数个其他领域的团队曾距离答案近在咫尺。这些团队的兴趣在于淋巴细胞，他们将BCL11A在小鼠中删除后，发现B淋巴细胞完全消失，作为对比，红细胞的数目和形态则丝毫不受影响，于是他们不再着眼于BCL11A在红细胞中的作用，也没有分析血红蛋白的成分。谁能想到，他们所放弃的方向，正是另一个领域几代人梦寐以求的答案呢？

至此，在沙漠中徘徊的人们终于来到了绿洲，很多实验室和制药公司也在运用这些知识来开发治疗两种贫血的方案，可是还有一些重要的科学问题仍然没有得到解决。

前文提到，全基因组关联分析证实了已鉴定的很多突变都可能是胎儿血红蛋白基因的负开关。那么BCL11A究竟控制其中哪个开关呢，又或者是控制某个尚未发现的开关？是否还有其他因子负责BCL11A不控制的开关呢？

这些问题不仅仅是珠蛋白转换这个科学问题中的重要一环，也为药物开发，尤其是基因治疗提供线索和理论支撑。后基因组时代已经有了很好的工具（如染色质免疫共沉淀）来专门回答这样的问题，但是这些工具却在BCL11A上面无一例外失效了。

又一个10年过去，BCL11A这个明星抑制因子，仍然披着一层神秘的面纱。

我在加入Stuart Orkin实验室后，试图回答这一问题。Stuart Orkin的研究多年来均得益于新技术，这一次，我们同样努力地寻找并尝试最新技术。幸运再次眷顾了有准备的人。我们尝试了一种最新发明的方法，在这种方法中，我们通过BCL11A的高亲和力抗体，将一种DNA剪刀精准地带领到BCL11A所控制的负开关区域，DNA剪刀把这段DNA剪切下来，通过二代测序技术，就可得到BCL11A所控制的负开关序列。这项技术的强大之处在于，DNA剪刀可以精准且高效地将负开关的核心区域剪切下来，帮助我们高精度地定位负开关的位置，这是以往的技术很难做到的。

我们的研究发现，BCL11A所控制的负开关，正是Francis Collins在1985年所报道的“希腊型突变”所在的位置（Liu et al., 2018）！该突变会破坏负开关，导致BCL11A无法正常行使功能，进一步造成胎儿血红蛋白被唤醒。我们在实验室使用CRISPR编辑系统破坏负开关，也同样会唤醒胎儿血红蛋白。前文提到，唤醒胎儿血红蛋白是治疗镰刀型贫血和β地中海贫血的方式，我们的研究证明了这个负开关可以作为基因治疗的潜在靶点。

30多年前，早期分子生物学技术和人类遗传学帮助人们找到了一系列的胎儿珠蛋白基因的负开关，而对应的抑制因子的身份却一直像一个谜团笼罩着这个领域；10年前，在全基因组关联分析的帮助下，抑制因子BCL11A千呼万唤始出来，它所控制的负开关却犹抱琵琶半遮面；而现在后基因组时代的工具则证明了BCL11A正是通过-117位置的负开关来关闭胎儿血红蛋白的。原来大自然早已经为人类提供了通向答案的线索。正所谓：蓦然回首，那人却在灯火阑珊处。

至此，横跨三个时代，30多年的研究终于交汇在了一起，一个大的图景也逐渐清晰起来。希望读者能够通过这篇文章感受到，红细胞为了完成珠蛋白转换，使用了多么复杂而精确的多级控制系统。这个系统是人体基因控制的一个漂亮范例，而无数个这样的系统，每天都在忠实地控制着人体数百种细胞中的数万个基因。人类个体之间DNA存在着大量的差异，它们大部分只是影响控制序列而不改变编码序列，这些差异或多或少地通过时间、空间和程度，微调着人体的基因控制系统，造就了每个独一无二的个体。这其中的奥秘，人类现在只窥见了冰山一角。

►不同发育时期的红细胞具有不同的珠蛋白控制系统。成体红细胞中，各种激活因子的组合打开了BCL11A的表达，后者则结合胎儿珠蛋白基因的-117负开关，将其关闭。在胎儿红细胞中，由于缺少必要的因子来激活BCL11A增强子，胎儿珠蛋白基因无法被关闭。BCL11A增强子和-117负开关的突变，都会在成体红细胞中重新激活胎儿珠蛋白。

一个研究领域死而复生的过程值得科研工作者们思考。

当我和其他领域的学者交流，提到正在研究珠蛋白基因控制的时候，经常会被问：“这个领域不是已经把问题都搞清楚了吗？”甚至同事们也会试图远离这个（大坑）领域，去追逐热门研究。事实上，如果没有人对珠蛋白转换这一古老领域的执着挖掘，就没有BCL11A的发现，贫血病人就离希望更远。同理，如果没有人坚持研究“最无聊”的组蛋白，就没有蓬勃发展的表观遗传学领域；如果没有人对细菌免疫这一“无用的”小众领域的坚守，就没有CRISPR的发现，基因编辑技术就无法像今天这样普及。

人们从来没有真正完全理解任何一个复杂生物学过程，古老的领域也存在着无数尚未发掘的瑰宝。珠蛋白转换领域是如此，其他任何领域都是如此，科学永无止境。心存敬畏，潜心耕耘，“stay hungry, stay foolish”。

参考文献

1. Liu, N. et al.(2018) ‘Direct Promoter Repression by BCL11A Controls the Fetal to Adult Hemoglobin Switch’, Cell, in press. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.016.

2. Martyn, G. E. et al. (2018) ‘Natural regulatory mutations elevate the fetal globin gene via disruption of BCL11A or ZBTB7A binding’, Nature Genetics.

3，PAULING, L. and ITANO, H. A. (1949) ‘Sickle cell anemia a molecular disease.’, Science,110(2865), pp. 543–8.

4. Pauling, L. and Zuckerkandl, E. (1963) ‘Chemical Paleogenetics. Molecular “Restoration Studies” of Extinct Forms of Life’, Acta Chemica Scandinavica, 17 supl, pp. 9–17.doi: 10.3891/acta.chem.scand.17s-0009.

5. Carter, D. et al. (2002) ‘Long-range chromatin regulatory interactions in vivo’, Nature Genetics, 32(4), pp. 623–626. doi: 10.1038/ng1051.

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7. Gelinas, R. et al. (1985) ‘G to a substitution in the distal CCAAT box of the Aγ- globingene in Greek hereditary persistence of fetal haemoglobin’, Nature,313(6000), pp. 323–325. doi: 10.1038/313323a0.

8. Bauer, D. E., Kamran, S. C. and Orkin, S. H. (2012) ‘Reawakening fetal hemoglobin: Prospects for new therapies for the β-globin disorders’, Blood, 120(15), pp.2945–2953.

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10. Royer-Pokora, B. et al. (1986)‘Cloning the gene for an inherited human disorder—chronic granulomatous disease—on the basis of its chromosomal location’, Nature, 322(6074), pp. 32–38. doi: 10.1038/322032a0.

11. Tsai, S. F. et al. (1989) ‘Cloning of cDNA for the major DNA-binding protein of the erythroid lineage through expression in mammalian cells.’, Nature, 339(6224), pp. 446–51. doi: 10.1038/339446a0.

12. Uda, M. et al.(2008) ‘Genome-wide association study shows BCL11A associated with persistent fetal hemoglobin and amelioration of the phenotype of β-thalassemia’, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(5), pp. 1620–1625. doi:10.1073/pnas.0711566105.