基因编辑先驱发现新的CRISPR/Cas系统-创新-知识分子

基因编辑先驱发现新的CRISPR/Cas系统

2019/02/07
导读
该系统在基因治疗领域同样具有光明的前景。

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Jennifer Doudna,图片来源:Doudna Lab

 

撰文 | 郝春晖

责编 | 叶水送


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有着“基因魔剪”之称的CRISPR/Cas系统凭借其优良的可操作性以及精准的靶向定位能力等特点,迅速取代了锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)等工具,成为了全世界实验室主流的基因编辑工具。

 

在CRISPR/Cas系统发展的历史上,加州大学伯克利分校的分子生物学家Jennifer Doudna贡献卓著,她不仅是最早发展CRISPR/Cas技术的科学家之一,其团队直至今日仍在努力完善这项技术。最近,Doudna团队在基因编辑领域有了新的进展。

 

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 2月4日,Doudna在《自然》杂志发表的论文,图片来源Nature

 

2019年2月4日,Doudna团队在《自然》杂志在线发表论文,揭示了名为CRISPR-CasX的新系统进行基因编辑的潜在机制,这势必会掀起基因编辑领域新的技术浪潮。

 

CRISPR/Cas系统原本是一种广泛存在于细菌和古菌中的RNA介导的适应性免疫系统。

其中CRISPR相当于“标记笔”,可被用来识别二次入侵的外源DNA,而Cas(CRISPR associated protein)则是一种可以切割DNA的核酸内切酶,是“基因魔剪”中的“剪刀”,利用CRISPR识别特定的DNA片段并对其进行切割。目前最常用的Cas酶是Cas9和Cas12a (Cpf1),尽管它们效率很高,但是依然存在一些问题:

 

1. 它们太大了(Cas9:1369个氨基酸、Cas12a:1353个氨基酸),因此将它们转入细胞中比较困难;

2.  Cas酶需要先识别入侵者的“身份证”(protospacer adjacent motif,PAM),如Cas9可以识别出的PAM序列是NGG,这就在一定程度上限制了Cas酶进行基因编辑的范围。

 

因此,人们一直在寻找更多的、体积较小的Cas酶。前不久,CRISPR/Cas系统的主要发明人之一,来自MIT的张峰及其团队报道了一种可以在哺乳动物和人体中进行有效的基因编辑的新系统CRISPR-Cas12b。

 

此项成果建立在Doudna团队2016发表在Nature的工作基础之上。彼时,她们与同样来自加州大学伯克利分校的微生物学家Jillian F. Banfield合作,利用宏基因组技术从地下水、沉积物、矿山酸性废水、土壤、婴儿肠道等环境中寻找CRISPR-Cas系统。这些环境中存在大量无法在实验室条件下培养的细菌,但是宏基因组技术可帮助科学家无需培养就能获取细菌的必要信息。通过生物信息学分析,研究人员发现了两种新的CRISPR-Cas系统——CRISPR-CasX和CRISPR-CasY,其中CasX仅有986个氨基酸大小。

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研究者利用宏基因组技术寻找到的新的Cas酶,图片来源: Nature

 

此次,她们先利用生物化学手段探究了CasX如何在体外切割双链DNA (dsDNA)。研究发现CasX酶必须在sgRNA(single-guide RNA)的引导下才能进入细菌对靶向基因组进行剪切, 二者合力能够切割带有与长度为20个核苷酸的指导RNA区段互补的序列、并且与序列为TTCN的PAM区域相邻的dsDNA。

 

通过绘制DNA的靶链(Target strand)和非靶链(Non-target strand)的切割位点的图谱,研究人员发现CasX会产生具有约10个核苷酸长度的交错双链断裂,这是因为CasX是在非靶链上的PAM区域之后12-14个核苷酸处和靶链上的PAM区域之后22-25个核苷酸处进行切割。

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CasX在体外切割dsDNA的模式,图片来源:Nature

 

进一步地研究,科研人员发现CasX可以在大肠杆菌与人类细胞中有效地沉默或编辑基因。

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CasX的分子结构,图片来源:Nature

 

这些发现证明CasX系统可被发展为有效的基因编辑工具。而CasX的小尺寸(<1,000个氨基酸)的特性则可使该系统相比于其他Cas系统更具优势。同时,CasX系统的切割模式以及其源自非病原微生物的特性,保证了该系统在基因治疗领域同样具有光明的前景。


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