合成生物学设计的目的之一是通过合成线路的理性设计赋予细胞新的功能。不过目前整个领域的发展主要聚焦在基因层次的调控设计。然而，自然细胞的诸多功能并不全部通过基因层次的调控实现，蛋白质层次的相互作用是另一种主要的调控方式。细胞利用蛋白之间的相互作用实现对特定的蛋白质本身的活性、定位以及稳定性等诸多参数的调控。比如，Caspase介导的细胞程序性死亡过程即是蛋白质水平调控的案例之一：蛋白酶之间通过切割过程彼此激活，启动下游信号的反应。

而合成蛋白线路相比于传统的转录调控线路具有更多的优势，比如更加快速的调控过程、与内源信号通路更加直接的偶联、可以直接将蛋白酶RNA转录本递送进目的细胞，无需将基因整合进目的细胞基因组之中。

蛋白质水平的合成生物学线路可以帮助我们工程化改造和设计更加强大的细胞行为。可组合的蛋白质—蛋白质调控系统将促进理性的蛋白质线路设计，其中各个蛋白质组分通过相互调控可以产生多样化的线路结构。

在这项研究中，研究人员展示了工程化的病毒蛋白酶可以作为可组合的蛋白质组分发挥作用。这种组合可以在哺乳动物细胞中实现多种功能。该系统中被称为CHOMP（circuits of hacked orthogonal modular proteases，分裂的正交化-模块化蛋白酶线路），其中作为输入信号的蛋白酶可以与靶蛋白酶实现结构上的对接并切割靶蛋白酶，从而以抑制靶蛋白酶的功能。通过组合这些元件，研究人员展示了这些组合可以生成级联调控、二进制逻辑门和动态模拟信号处理功能。

二进制逻辑门：OR、AND、NOR、NAND、IMPLY、NIMPLY、XOR、XNOR

Bandpass circuit & Adaptive pulse ciruit

为了证明该系统的实用性，研究人员理性地设计了一种合成线路，该线路可以响应Ras致癌基因的上游激活因子而诱导细胞死亡。CHOMP线路可以执行复杂功能，同时可以编码为单个转录本，并且无需基因组整合即可整合进细胞之中，这将有力的促进蛋白线路在生物技术领域的应用。

Ras-conditional Caspase-3 circuit

现代计算机计算过程主要基于时序逻辑，其中电路的状态取决于当前输入信号以及过去的输入信号（记忆）。将时序逻辑植入活细胞可以使其通过离散状态执行相应的生物过程。例如，利用时序逻辑可以使细胞分化成多细胞结构或者令生物材料的组装过程按照一定顺序进行。然而，时序逻辑的设计存在着重大的挑战，即时序逻辑的实现需要在基因线路中植入反馈调控，但反馈调控不仅难以设计同时很难扩大规模。

在这篇文章中研究人员提出了一种用于设计时序逻辑基因线路的定量方法。 此方法使用“NOT”逻辑门作为调控的核心单位【“NOT”逻辑：输入启动子驱动阻遏蛋白的表达，而阻遏蛋白酶用于关闭输出启动子】。 通过测定其响应函数（response function，改变输入如何影响稳态下的输出），研究人员对每种NOT逻辑门进行了详细的表征。 同时，响应函数被视为Nullclines，来自非线性动力学（相平面和分叉分析）的工具用来预测不同逻辑门的组合如何对稳态和动力学行为产生影响。 

The response functions are treated as nullclines, and tools from nonlinear dynamics (phase plane and bifurcation analyses) are applied to predict how combining gates leads to multiple steady states and dynamics.

这项工作中，研究人员将时序逻辑应用于细胞检查点（checkpoint ）的控制，其中只有正确的信号出现后，细胞才会转向下一状态。 研究设计的基因线路可以指导大肠杆菌进行线性或循环的状态切换。

Sequential logic for checkpoint control

这项工作根据简单的规则，通过组合可靠的调控逻辑，向我们展示了在细胞中实现时序逻辑线路的定量方法。 这种方法有利于相应自动化软件的设计，同时自动化软件可以利用这些规则来构建规模更大的由不同逻辑门组合线路。 这为建立具有反馈回路的调控基因网络提供了一种可行的设计途径。反馈回路这对许多细胞功能至关重要，并且在自然网络中无处不在。 这项工作代表着我们向在细胞内执行高级计算迈出了关键的一步。

这篇文章向我们展示Christopher Voigt实验室强大的复杂基因线路设计功力，文章的深度和复杂性也让读者有点望而却步。难怪帝国理工大学的合成生物学学者Tom Ellis Twitter发文称：“Synthetic biology is getting pretty complex. Trying to wrap my head around these diagrams in the latest logic-based tour de force from the Voigt lab.”

《Science》同期刊发了David S. Glass和Uri Alon对两篇合成生物学文章的评论文章，其中重点谈及了“可组合性”对于合成生物学的重要性。

以下是对此篇文章的翻译，并对部分内容进行了部分增添和修改。

合成生物学领域目的之一便是设计用于编程细胞和组织的遗传线路。这些线路将使细胞能够检测疾病并采取行动对其进行补救；指导细胞产生有用的物质和材料；甚至允许细胞自组装成新的、用户定义的组织结构[1]。随着合成生物学元件库的逐渐增加，细胞中的基因线路从包含几个元件的线路开始[2, 3]逐渐发展成为越来越大且复杂的线路。但这些基因线路的复杂性和规模却一直是有限的，其中设计大型合成生物学系统的一个关键挑战便是【可组合性（Composability）】：连接任意元件并实现可预测行为的能力。在本期《Science》，Gao 等人[5]描述了一种基于蛋白酶的可组合的合成生物学系统；Andrews 等人[6]描述了一种具有多种状态的时序逻辑系统。最近，Toda 等人[7]使用合成细胞细胞信号传导来驱动细胞的分化和粘附使其形成了多细胞结构。这些研究表明，对“可组合性”的研究可以使合成生物学超越传统的限制，进一步拓展到更大的发展空间之中。

可组合性是一个相对微妙的概念，其中重要的是要记住几个相关但不同的概念。合成生物学中的正交性（Orthogonality）指不会干扰或彼此干扰最小化的元件。这相当于元件之间缺乏串扰。例如，如果两个转录因子不调节彼此的启动子，则它们是正交的。模块化（Modularity）是指可以划分为子系统的系统，每个子系统都具有定义明确的功能。这些概念适用于蛋白质分子、转录基因线路和多细胞系统等多个层面。

可组合性是比正交性或模块性更严格的标准。可组合的元件是具有匹配输入和输出的模块化单元，任何两个元件可以相互连接并产生可预测的行为。元件及其接口的标准化是开发这种“即插即用（plug-and-play）”功能的一种方式。与生物线路相比，即使是通常被认为易于设计的电子电路也不一定是可组合的，如果输入和输出阻抗设计不合适，组合的电子元件也可能会失败; 生物线路中的类似概念被称为追溯效力（Retroactivity，指信号通路下游的系统给上游系统带来信号反馈，从而影响上游系统功能的效应）。自然系统也具有大致上的模块性和正交性，但是仍无法满足合成生物学对元件的工程化要求。因此，合成生物学家必须仔细地改造自然元件来获取可组合性。

合成生物学的一个重要目标是将基因调控水平的线路设计（由于蛋白产生的缓慢时间，调控为小时级别）转向蛋白质—蛋白质相互作用的调控线路，因为蛋白质—蛋白质相互作用可以在几秒到几分钟内发生。蛋白线路不仅速度更快，而且还提供强大的功能，包括直接与细胞信号网络偶联、在不同的亚细胞位点执行功能。但是目前蛋白线路的主要问题在于缺乏可组合、可预测的调控蛋白工具包。

Gao等人使用称为病毒蛋白酶的分子剪刀解决了这个问题。利用结合结构域、降解标签和正交化切割位点，他们设计这些蛋白酶以可编程的方式特异性地进行彼此之间的相互调控。

由于蛋白酶相关模块之间的可组合性，研究人员设计了基于蛋白酶相互作用的双输入布尔逻辑门。研究人员还设计了更复杂的线路，包括脉冲发生器（pulse generator）。他们甚至使用蛋白线路选择性地杀死携带驱动癌症发生的蛋白质的细胞。所有这些都发生蛋白质水平，并且全部编码在单个RNA分子上。这种能力扩大了使用合成线路作为治疗方案的可能性，因为蛋白线路能够通过RNA递送进细胞之中，同时不需要对基因组进行任何编辑。

合成生物学的另一个目标是设计时序逻辑线路。基于可组合的转录因子，Andrews 等设计了具有可逆状态的时序逻辑线路。这种发展依赖于对置位—复位锁存器（set-reset latches）库的详细表征，每个锁存器由调节转录因子组成，受到其他转录因子的调节并能够调节其对应的转录因子。研究人员将这些锁存器与逻辑线路组合成可以记住多个事件的状态机（称为数据锁存器）。这种锁存器可以被设置不同的状态，同时也可以锁定在某一状态，以及其可以在不同化学信号控制下在多个状态之间进行循环切换。这些线路设计可用于环境信号的检测，例如，在细胞响应信号合适之前必须发生的一系列和检查点相关的“Go or No-Go”事件。

可组合性也可以应用于多细胞水平，将单个细胞视为可组合单元，不同细胞以可预测的方式彼此交互。合成多细胞系统有望帮助组织再生和产生能够响应环境的结构化生物材料。这些能力的关键是细胞—细胞信号传导，细胞分化和细胞粘附系统。研究人员已经使用合成信号传导和分化（或记忆）上实现特定细胞的模式形成。最近，可组合细胞胶联（粘附素）系统被用于从生物物理层次编程细菌中的细胞—细胞相互作用，这使得在单个细胞的尺度范围内细胞自组装成三维（3D）模式成为可能。

Toda 等人通过可组合的一组分子“锁”和“钥匙”（合成的邻分泌信号传导）对组织进行编程使其分化成为多细胞结构。相邻细胞可以相互激活粘附分子的表达，并分化成新的细胞类型。此系统的时序步骤通过基于粘附的细胞分选过程实现自驱动（见下面视频）。此处的细胞分选是一种生物物理过程，其使细胞直接接触从而促进信号传导。通过此种方式得到的多细胞结构让人联想到胚胎发育过程，两者具有相似的行为，例如对称性破坏和损伤后的再生。通过合成信号调控粘附过程使得该过程比纯粘附结构更加可控和通用化，开辟了人工开发系统研究体外发育的研究道路。

在未来，特别是当集成不同调控水平的线路组成更强大的系统时，可组合性可能会扮演着重要的角色。基于重写或切除DNA的记忆过程，如果运用灵活的时序逻辑调控实现，我们不仅可以设计具有长期稳定性、规模更大状态机，同时也就不再需要活跃的蛋白质表达过程来维持记忆。基于蛋白质的线路结合转录逻辑可以在多个时间尺度上协调合成生物学调控过程。在多细胞环境中，将信号传导和粘附过程耦合时序逻辑可以使可设计的发育调控程序规模更大化。虽然这些整合性的合成生物学调控网络在自然界中均可以找到对应物（例如，动物发育和细胞信号传导网络），但是合成线路可以更好的阐明原生系统：人们可以通过在真实的生物环境中构建线路来测试计算机模拟的结果，而这种过程并不会像那研究原生系统那样充满未知因素。随着通过时序逻辑、蛋白线路和多细胞系统的可组合工具包解决掉合成生物学长期以来的部分限制因素，生物医学的工程化设计和“Build to understand”的未来是光明的。

注：本文来自微信公众号“再创”