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撰文 | 商 周
责编 | 陈晓雪
在众多的哺乳动物里，蝙蝠是一个较为特异的物种。因为有着独特的免疫系统，它们可以和很多病毒长期共存。这样的和平相处对蝙蝠来说是好事，但对其它哺乳动物就可能意味着麻烦。作为众多病毒的自然宿主的蝙蝠，就像一个潜在的炸药库一样，不定期地把危险释放出来。比如我们熟悉的人类SARS病毒，还有更加致命MERS病毒，它们的自然宿主就是蝙蝠。而今年让地球人都知道的新冠病毒，就像它的亲戚SARS和MERS病毒一样，同样与蝙蝠冠状病毒最为亲近。虽然众多让人致病的病毒都源自蝙蝠，但因为人和蝙蝠接触不多，而且两者在进化上相差也较远，所以一般病毒不会直接由蝙蝠传给人。通常是蝙蝠把病毒传给一个物种，病毒在这个物种身上进化一段时间以后再传给人，这个在中间起到过渡的物种就叫中间宿主（可能是一个，也可能是多个）。比如骆驼是MERS的中间宿主，而SARS病毒的中间宿主之一是果子狸。那么全世界都在关心的新冠病毒SARS-CoV-2呢？根据中科院武汉病毒所的研究，在已知蝙蝠里的冠状病毒中，和新冠病毒最为相似的是蝙蝠的冠状病毒 RaTG13, 两者在基因序列上的相似性达到了96.2% [1]。虽然这是一个很高的数字，但从分子进化的角度来说两者相差还是比较远,至少蝙蝠 RaTG13 病毒不可能直接一下突变成新冠病毒并传给人，需要在另一个物种里完成那4%的大部分变异。这意味着，在蝙蝠和人类之间，很可能还是中间宿主的存在。而鉴定出这个中间宿主，无疑将帮助我们对新冠肺炎的防控。我们以SARS 病毒为例，看看果子狸是如何被鉴定为中间宿主的。因为SARS暴发的初期，一些病人是餐馆里负责处理野生哺乳动物的工作人员，所以一个来自香港的研究团队把目光集中到了深圳经营野生动物的市场。通过对市场里的一些动物（包括海狸、雪貂、野兔、麂、猫、猪和果子狸等）取样，他们发现果子狸身上带有一种和SARS病毒在基因序列上相似程度达到99.8%的冠状病毒，而且不是人传给果子狸的 [2]。果子狸这个中间宿主，就是这样被鉴定出来的。和SARS类似的事情也发生在了新冠病毒身上，早期的新冠病例里有不少和武汉华南海鲜市场有关联 [3]。所以一个可能的情形就是，新冠病毒的中间宿主出现在武汉华南海鲜市场里，科学工作者用同样的方法就可以把它找出来。但出于防疫的考虑，华南海鲜市场在1月1日被关闭 [3]，中国疾控中心在当天从华南海鲜市场获取了一些动物和环境标本。根据新闻报道，检测结果表明在市场里的22个摊位和1个垃圾车上有新冠病毒存在 [4]，而动物身上却没有发现病毒 [5]。众多摊位上出现了新冠病毒，确认了这个病毒在华南海鲜市场上的存在；而所检测的动物身上没有发现病毒，一个可能的解释是所检测的动物的种类和数量不够。因为华南海鲜市场关闭得早，除了中国疾控中心的人员外，目前并没有看到是否有其他单位的研究人员获得了市场里的动物标本，并利用市场里的动物做进一步的研究的报道。不过，这也不意味着就没办法了。研究人员正在使出各自不同的招数去开展这项工作。让我们一起看看，到目前为止有哪些动物被认为可能是中间宿主，科学家又是如何提出假设、如何去验证、如何评价同行工作的。率先登场是来自中国北京大学等五个科研单位的团队。1月17日，他们完成了关于新冠病毒中间宿主的研究论文并投稿到《 Journal of Medical Virology 》（医学病毒学杂志），四天后被接受并发表 [4]。这项研究给出的结论让人惊讶不已：中间宿主可能是蛇。图片来源：www.pixabay.com
这一结论难免让人惊讶，因为蝙蝠和人都是哺乳动物，而蛇是爬行类。如果病毒要在蝙蝠和人之间找一个中间宿主，一个更符合逻辑的选择应该也是一种哺乳动物，而不是爬行类。那么，作者是如何得出这个 “不太符合逻辑” 的答案的呢？先看作者的科学假设：病毒和它的宿主在 “同义密码子偏好” 上应该相近。这一假设听上去好像有点道理，病毒为了更好地在宿主细胞里生存，那么它最好和宿主有着同样的同义密码子偏好。这样，通过对病毒和可能的宿主进行同义密码子偏好分析，可以为寻找病毒可能的宿主提供依据。接下来看作者的研究发现：在武汉菜市场常见的几种动物（蛇、鸡、穿山甲、蝙蝠、旱濑、蝙蝠等），新冠病毒和蛇在同义密码子偏好最为相近。根据这一主要发现，作者认为蛇可能是新冠病毒的中间宿主。一方面，作者没有证明他们的假设的基础是合理的。虽然病毒和和宿主在同义密码子偏好上相似的确会对病毒有利，但这不意味着中间宿主就一定和病毒在这一点上相近。要证明这一假设的合理性，可以用已知中间宿主的病毒来验证一下。比如找SARS病毒和果子狸，看看它们在同义密码子偏好上是否相似。因为新冠病毒和SARS病毒相近，使用的同义密码子也非常相似。根据作者的结果来看，一个肯定可以预测到的事实是：在同义密码子偏好上，蛇比果子狸更和SARS病毒相似。但事实显然并非如此。也就是说，作者的假设的基础并不合理。另一方面，就算作者的假设合理，那么选取作为研究对象的动物也是一个问题。这项研究选择了蛇、鸡、穿山甲、蝙蝠、旱濑和蝙蝠，那么如果再多家几个物种（尤其是比蛇更 “低级” 一点的物种），会出现什么结果呢？一项来自美国密歇尔根大学的研究回答了这一问题，他们把同样在菜市场常见的青蛙加进去分析，结果发现：在同义密码子偏好上，青蛙比蛇更和SARS病毒相似 [5]。所以，通过分析同义密码子偏好，这个团队并没有证明蛇是新冠病毒的宿主。有趣的是，蛇并不是唯一被认为可能是新冠病毒中间宿主的爬行类动物，另一个是乌龟。乌龟给人的印象是长寿，但其实它还有另外一个特点，就是也能和很多病毒和平共处。从这个意义上来说，乌龟有点像爬行类动物里的蝙蝠。另外，乌龟也在菜市场常见，这也吸引到了科研人员的注意力。图片来源：www.pixabay.com
开展这项研究的，是来自湖北医科大学等四个单位组成的研究团队。有趣的是，这一项研究同样发表在《 Journal of Medical Virology 》（医学病毒学杂志）上。从投稿到接受只有短短的5天 [8]。所发表的论文截图
先看作者的假设：新冠病毒的S蛋白和宿主的ACEII有着更好的结合力，所以有能够与新冠病毒S蛋白结合力更好的ACEII的物种就可能是中间宿主。这个假设听上去也有些道理，病毒的S蛋白和宿主的ACEII结合让病毒进入宿主细胞，所以宿主的ACEII应该能和新冠病毒的S蛋白结合，而且结合越好越有利于病毒的感染。再看作者的发现：作者用生物信息学的方法模拟了S蛋白和ACEII结合的情况，通过分析了多个动物（人、猩猩、猴子、仓鼠、猫、狗、穿山甲、蛇、乌龟、蝙蝠、小鼠）的ACEII的蛋白上和S蛋白结合的关键氨基酸，他们认为乌龟的ACEII和新冠病毒结合最好。所发表论文截图
根据这一结果，作者认为乌龟可能是新冠病毒的中间宿主。主要是两个方面：第一，作者同样没有证明他们的假设的合理性。就像上面提到的一样，这种合理性可以用已知的病毒和它们的宿主来验证，比如用SARS病毒和果子狸。第二，作者在评估S蛋白和ACEII的结合能力的时候，并没有给出一个量化的指标，而只是一个定性的分析。实际上，在后来的一项于4月1日提交到 ChemRxiv 网站的研究中，一个来自华中科技大学的团队把这些都做了 [9]。通过分析蝙蝠冠状病毒RaTG13的S蛋白与82个动物ACEII的结合力发现，自然宿主（蝙蝠）的ACEII不仅不是与它的S蛋白结合得最好的，就是连前几名都没有排上。换句话说，通过分析病毒S蛋白与动物得ACEII的结合力的方法，并不适合用来鉴定病毒的宿主。所以，认为乌龟是新冠病毒的宿主的观点同样没有给出让人信服的证据。蛇和乌龟都是爬行类，它们成为新冠病毒的中间宿主的可能性不大，并不是说完全没有可能。科学上提倡大胆假设，但同时需要小心求证。显然，提出蛇和乌龟是中间宿主的两项研究只做到了前者。
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狗是常见的人类宠物，是和人类接触最密切的动物之一。当听到狗可能是新冠病毒的中间宿主的时候，不少人都会暗暗担心。别着急，还是先看看论文。
4月14日，《 Mol.Biol.Evol. 》（分子生物和进化）杂志发表了一篇的题为“ Extreme genomic CpG deficiency in SARS-CoV-2 and evasion of host antiviral defense ” 的论文，作者来自加拿大渥太华大学 [10]。
就像题目里体现的那样，这项研究主要探讨的并不是谁是新冠病毒的中间宿主，而是寻找新冠病毒的一些特点，然后试图从病毒与宿主共同进化的角度上去给予解释。
作者研究的新冠病毒的CpG的含量。CpG是基因序列上的C和G两个连在一起的碱基的缩写，在脊椎动物中CpG的含量很低，而且有被甲基化的倾向。而在微生物的基因组中CpG的含量较高，甲基化的倾向也低。所以我们的免疫系统可以利用这一点，去识别微生物并对它们进行攻击。我们的细胞里负责识别病毒CpG的，是一个名叫ZAP的分子。
当然，面对这样的打击，病毒也会有相应的办法。在ZAP分子的高压下，一些病毒就会尽量去降低自己的CpG 的含量。
在这项研究里，作者就发现新冠病毒，还有和它相近蝙蝠冠状病毒RaTG13，有着较低的CpG 含量。而且在作者调查的众多动物冠状病毒里，只有狗身上的几个冠状病毒CpG的含量也很低，和新冠病毒相当（见下图）。
发表论文结果截图
作者认为，狗的多个冠状病毒的CpG含量低，说明了狗的细胞里的ZAP分子对冠状病毒的压力可能很大。根据这一点，作者在论文的讨论里对新冠病毒的起源做了一个这样的推测：“首先，新冠病毒和蝙蝠RaTG13病毒的祖先感染了狗的肠道，比如通过狗猎食蝙蝠进入；其次，这个病毒在狗的细胞里因为ZAP分子的压力，而进化出了较低的CpG含量；最后，有着较低CpG含量的病毒再传播到其他物种（比如人）的时候，人的ZAP分子可能对这个病毒就没有多大的威力，所以病毒的致病能力就增强了。”如果按这种说法，狗就不是新冠病毒的中间宿主，而是远古以前的一段时间里的宿主而已。但作者又做了进一步的补充：“然而，也存在一种这样的可能，这里面的一支冠状病毒最近在狗的肠道系统里获得了较低的CpG含量，然后再传染到其它物种身上”。显然，作者在这里暗示，狗有可能是新冠病毒的中间宿主了。应该说，这项研究还是相对严谨的，作者并没有直接声明狗就是新冠病毒的中间宿主，而是暗示存在这种可能。作为百姓，人们关心的是狗到底有没有可能是新冠病毒的中间宿主。如果是，那无疑将会影响到百姓的生活。给出否定答案的是来自中国农科院哈尔滨兽医研究所的一个团队。在这项研究里，作者通过用新冠病毒去感染一些和人类有接触的动物，发现雪貂和猫对新冠病毒易感，而病毒在狗、猪、鸡和鸭的身体里则很难增殖，更不会导致传染。上面谈到的蛇、乌龟以及狗，它们被认为可能是新冠病毒中间宿主的证据都不是实验性的，而是根据一些生物信息学的分析。研究人员之所以不能用实验性的直接证据来说明问题，一个重要的原因就是这样的证据不容易获得。就像鉴定出SARS病毒的一个中间宿主一样，直接证据就是从果子狸身上分离出了和SARS病毒高度相似的冠状病毒。当然，不少研究人员在为此付努力。而且也发现了一些有意思的线索，这就是穿山甲的冠状病毒。从二月份开始，先后有至少四个团队（2个来自广东，1个来自云南，1个来自香港）发表了关于发现穿山甲冠状病毒的论文 [11-14]。这个新发现的穿山甲冠状病毒与新冠病毒在基因序列上的相似性为91%左右，低于蝙蝠 RaTG13 CoV 与新冠病毒的相似性（96%）。而这三个病毒的关系，基本上可以用下面这个图来总结：图片来源：参考链接[13]
1. 在全基因组水平上，蝙蝠RaTG13 CoV 和新冠病毒更相近，而穿山甲冠状病毒远一些。
2. 在与ACEII结合的几个关键的氨基酸上，穿山甲冠状病毒和新冠病毒更加相近，而蝙蝠RaTG13 CoV远一些。3. 在新冠病毒上的一个插入的FURIN酶切位点上，蝙蝠RaTG13 CoV和穿山甲冠状病毒更加相近，而新冠病毒远一些。因为从穿山甲身上分离出的冠状病毒和新冠病毒只有91%的相似性，我们不能认定穿山甲就是新冠病毒的中间宿主。但同时也不能排除这种可能，因为穿山甲冠状病毒的发现说明，新冠病毒可能可以在穿山甲身上存在。
那么，除了穿山甲外，哪些物种还可能成为新冠病毒的中间宿主呢？确定一个物种是中间宿主很难，但认定一个物种不是中间宿主则要容易得多，而且这样的排除法也会给我们控制新冠病毒带来一定的帮助。最近，一篇发表在《 Transbound Emerg Dis. 》杂志上的论文就这个问题做出了探讨。来自西北农林大学、北京农业大学以及洛阳国家兽医研究中心的研究人员测试了35种动物（共1914只）的血清，检测它们是否有针对新冠病毒的抗体 [15]。发表论文截图
这项研究的假设是：感染有新冠病毒的中间宿主应该会产生针对该病毒的抗体，所以通过检测动物血清里的抗体的方法能确定这个动物是否感染有新冠病毒。如果没有，那就可以排除这种动物作为中间宿主的可能。发表论文结果截图
结果就像上图所示，35个物种，1914只动物，包括实验室动物、家禽、宠物、以及野生动物的血清全部是阴性，都没有针对新冠病毒的抗体。根据这一结果，作者认为这35种动物都不可能是新冠病毒的中间宿主。1. 所检测的动物选择有问题。一是有些居然是实验室里SPF动物，也就是没有特定病原体的动物，这些动物当然不会有新冠病毒；二是方法部分并没有给出具体的详细的动物信息，比如采集地点和时间，这同样会影响到实验的结果。
2. 也是更重要的，有限量的动物的血清里没有抗体，并不能代表这个物种不是中间宿主，因为完全可能是抽样的时候没有抽到感染的动物。一个例子就是果子狸，它是SARS病毒的一个中间宿主，研究人员就发现大量的果子狸（尤其是野外生长的）并没有被SARS病毒感染 [16]。所以，根据这样的实验结果，把上面35种常见的动物排除在中间宿主之外，是一个并不谨慎的做法。既然通过检测血清里针对新冠病毒的抗体的方法难以排除中间宿主，那么哪一种方法才是可取的呢？作为可能的中间宿主，它必须满足一个条件：能被新冠病毒感染，病毒能在它的体内增殖，而且能再从它身上再传给其它动物。以上标准的检验过程，可以在实验室里进行，也可以通过分析自然的感染（比如通过病人传给动物）来获得答案。数据来源：参考链接[17]
毫无疑问，这个表格还需要完善。只有更多的可能在华南海鲜市场上出现的动物（尤其是哺乳动物）的信息完整之后，我们在这一问题上才能有更好的了解。但从现有的情况来看，家禽、狗、猪都可以被排除，因为它们不易感；而其它动物都有成为中间宿主的可能，虽然可能性的大小不一。还有一点不能排除的是，可能不需要中间宿主，蝙蝠直接把病毒传给人类。总之，虽然相关领域的研究论文已经有了十余篇，但鉴定新冠病毒的中间宿主的工作远没有完成。因为缺乏华南海鲜市场的标本，研究人员不得不采取各种间接的方法去努力。鉴定新冠病毒的中间宿主可能还会是一个漫长的过程，正是在这个过程里，研究人员的科学精神和科学方法得到彰显。
参考链接
1.Zhou et al. Nature. 2020 Mar;579(7798):270-273.2.Guan et al. Science. 2003 Oct 10;302(5643):276-8.3.Li et al. N Engl J Med. 2020 Mar 26; 382(13): 1199–1207.4. http://www.xinhuanet.com/2020-01/27/c_1125504355.htm5. http://china.qianlong.com/2020/0527/4194590.shtml6.Ji et al. J Med Virol. 2020 Apr;92(4):433-440.7.Zhang et al. J Proteome Res. 2020 Apr 3;19(4):1351-13608.Liu et al. J Med Virol. 2020 Feb 26;10.1002/jmv.25726. 9.Wu et al. doi.org/10.26434/chemrxiv.12057996.v110.Xia et al. Mol Biol Evol. 2020 Apr 14 : msaa094.11.Liu et al. PLoS Pathog 16(5): e1008421.12.Lam et al. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-020-2169-0 (2020).13.Zhang et al. Curr Biol. 2020 Apr 6;30(7):1346-1351.e2.14.Xiao et al. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.17.951335v115. Deng et al.Transbound Emerg Dis. 2020 Apr 17;10.1111/tbed.13577. doi: 10.1111/tbed.13577.16. Shi et al. Virus Res. 2008 Apr; 133(1): 74–87.17.https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Our_scientific_expertise/docs/pdf/COV-19/A_Factsheet_SARS-CoV-2.pdf 制版编辑 | 皮皮鱼
