听诺奖得主的“徒孙”,讲讲酶进化的那些事儿-深度-知识分子

听诺奖得主的“徒孙”,讲讲酶进化的那些事儿

2018/10/12
导读
为什么诺贝尔化学奖在酶分子定向进化技术上仅颁给Arnold教授?


「正是由于这项技术的诞生,我才有幸在博士期间从事酶定向进化技术的研究,完成我的博士课题。」


撰文 | 李振伟

编辑 | 李研


瑞典当地时间10月3日中午,北京时间下午5:45,2018年诺贝尔化学奖被授予三位生物化学专家。


其中,美国科学家弗朗西斯•阿诺德(Frances H. Arnold)获得了一半奖金,以表彰她在酶的定向进化领域所作出的杰出贡献。


Frances H. Arnold(图源:phys.org)


作为酶催化领域,尤其是分子定向进化的先驱,Frances H. Arnold教授名字可谓是业界周知。正是由于她率先在该技术上的突出成就,才使得酶促生物合成进入了全新的时代。

 

听说Frances H. Arnold教授获奖,我倍感振奋。正是由于这项技术的诞生,我也才有幸在博士期间从事酶定向进化技术的研究,完成我的博士课题。虽然现在我已离开酶定向进化的一线研究数年,但该技术给我个人职业生涯带来的欣喜依然深刻的留在记忆中。


生物催化剂——酶

在具体介绍酶分子定向进化技术之前,请允许我先讲述一些背景知识,以便大家更好地理解这项诺奖成果。


酶分子定向进化技术是酶催化领域上游核心技术之一。所以,我们首先得清楚什么是“酶”。而这个故事要从分子说起。


我们知道,自然界所有的物质都可以看做是由原子构成的大大小小的分子。氧气(O2)和水(H2O)等小分子,仅由几个原子构成,而大分子,如蛋白质分子由几万、几十万原子(通常用kDa为单位)构成。


分子之间可以通过化学反应互相转化,从一种化学分子到另一种化学分子的过程,伴随着一些化学键的生成和解离。在这个过程中,有些可以自发生成,但大多数情况需要在特定的条件下才能发生。


所以,在化学合成中,高温、高压是常见的反应条件,因为反应中需要输入足够的能量才能使反应得以进行。为了让化学反应能够更高效地进行,自然界有她独特的方法——催化剂。


我们用爬山来打比方。从山的一头到另一头,没有催化剂的时候,需要翻过很高的山才能到达;但是有了催化剂,就只要爬过矮矮的丘陵就可以,比起之前的高山容易多了。


一般的催化剂,包括酸碱、金属、过渡金属和过氧化物等。但在众多催化剂中,有一种特别突出,那就是酶。酶是一种极为高效的特殊催化剂,可以说是大自然馈赠给我们的礼物,其化学本质是具有催化活性的蛋白质或核酸。所有生物正是由于酶这种天然生物催化剂的存在才得以生存繁衍。


生物酶和普通催化剂的区别在于,前者能更大幅度的降低反应活化能,使反应更容易进行,就好比我们从出发地只要跨过一个小坡就能到目的地。


(图源:jpkc.scezju.com)


正是由于酶如此重要的地位,才造就了近20位和酶学研究相关的诺贝尔奖得主,而本次Frances H. Arnold教授的获奖为酶学领域新添了一枚奖牌。


酶工程

通常,酶只有在生物体内才能行使高效的催化活性。在生物催化技术发展早期,从生物体内提取的酶通常很不稳定,再加上其生产成本高昂,在相当长时间内仅限于实验室研究,离产业化非常遥远


一个世纪前,科学家发现活体细胞的某些成分可以用于化学转化,但这个时期还停留在实验室阶段,算是生物催化的萌芽阶段。在上个世纪八、九十年代,蛋白质工程兴起,扩宽了生物酶的底物范围,使得生物催化的领域拓宽到非天然的医药中间体和精细化工领域。但这个时期还主要处于小试规模,没有形成大规模工业化生产。


为了解决酶本身的诸多问题,科学家们做了相当长时间的努力和探索,学术界数十年来想了很多法子来提高酶在工业应用中的稳定性,但一直收效甚微。直到1993年Frances H. Arnold教授率先提出“酶的定向进化”概念,并用于天然酶的改造,情况才发生了变化。


酶分子定向进化

在理解“酶分子定向进化”技术之前,我们不妨先回顾一下“进化”的基本原则。


“物竞天择、适者生存”,达尔文的进化论阐释了物种进化遵循的一些前提和假设,而这套理论可以很容易利用下面这张循环图来解释。


(图片由作者提供)


当环境发生恶劣变化后,物种繁殖的后代中出现了少数变异,这些变异者比非变异者更适合变化后的恶劣环境,于是它们被环境选择,存活了下来,原来的变异被固化,从而实现了物种的进化。后来,新一轮环境变化发生,变异、选择和进化的循环再次开启。


这个基本模型就是达尔文进化论的核心。


上过高中生物课的朋友也许还有印象。生物体的外在性状主要是由蛋白质体现出来的,而蛋白质的产生遵循“中心法则”,但是性状最终是否被表达和留存取决于环境。因此可以说,所有的变异都源自基因的变化,所有的进化都是基因适应环境的效应。


那“酶的定向进化”技术指的是什么呢?


(图源:Schwaneberg et. al. Electroanalysis (2008) 22:765-75)


具体来说,首先得在编码酶的基因水平上,尽可能多地人为造成随机突变或重组,形成一个庞大的基因突变库,然后在基因表达出相应的酶蛋白突变体库。

简单说,就是更多地产生尽可能多的变异后代。


然后,在人工模拟恶劣环境或要求下(比如高温、高毒性)从这个库中定向筛选出具备理想性状的蛋白突变体(比如高活性、高选择性、高稳定性等)。

简单说,就是从这些后代中选出你中意的一个或几个。


最后,从选出来的突变体中提取它的基因,并作为母本,进入下一轮酶基因突变库建立,实现酶的进化。

简单说,就是提取这个后代的基因,然后依次不断地循环上述过程,直到发现你最最中意的那个!


1993年,正是Frances H. Arnold首先提出了以上酶分子定向进化的概念,并使用易错PCR(error-prone PCR)的方法改造天然酶,以及构建新的非天然酶。


这也是为什么参与并建立酶定向进化研究者不少,但诺贝尔化学奖在酶分子定向进化技术上仅颁给Arnold教授的原因。


自此,酶分子定向进化技术得到了前所未有的发展和进步。


技术应用

正是由于酶定向进化技术的发展,脆弱的天然酶就可以在实验室里,按照人们设定的恶劣环境,实现试管中的进化,摇身一变成为符合工业生产要求的、更加稳定的变异酶。


酶定向进化技术的出现,伴随着基因合成、测序成本的下降以及计算机辅助的分子模拟技术的发展,使得生物催化技术极大地拓宽了应用价值。这个时期开始,生物催化技术参与的产品工业化规模开始出现,从而极大地提高了一些化学药物合成的效率。


以我们最熟悉的头孢类抗生素为例,之前需要13步化学合成,如今只要2步酶催化就可以,而且后者更绿色环保,成本也只有前者的一半


图片由作者提供


由于酶催化工艺突出的优势,越来越多的药物合成案例不断涌现,取得了巨大的商业成功。以下是部分已经投放市场的通过酶催化合成的药物。


图片由作者提供


展望

经过20多年的发展,酶分子定向技术成果丰厚,除了上述提及的在药物合成领域的巨大产业化成就外,该技术在方法论领域的研究也是百发齐放,不断进步。


近几年,酶分子定向进化技术已经从原来的1.0时代进入了2.0时代。由于生物信息学的发展,海量关于序列和结构数据被获取,计算机辅助设计和基于结构信息的分析水平进一步提高,从而使得现有的酶分子进化策略越来越采用联合方法实施,并取得了更为明显的效果。


最后,我想介绍一下我熟悉的酶定向进化专业实验室。


图片由作者提供


最左边就是本次获奖的Frances H. Arnold教授,中间这位是德国最著名的酶定向进化专家Reetz教授,该技术的开创者之一。最后一位是我博士导师,Schwaneberg教授,正是他当年师从Arnold教授,将酶定向进化技术带回德国,建立了实验室,我也才有幸学习到这项技术。


相信随着酶定向进化技术获得诺奖,生物催化领域将进一步得到推动,迈向新的高度。


作者简介

李振伟,一个非典型理工男,生物化学专业,毕业于德国亚琛工大,从事酶和生物催化相关研究和产业化工作已近十年,致力于推动生物催化技术在国内外的推广和产业化。平时经常不务正业,除了是外语重度爱好者外,还喜欢跳尊巴舞蹈,自称烧的一手好菜,写得一手好字。


参考资料

[1] Sheldon, R. A., & Brady, D. (2018). Chemical Communications, 54(48), 6088–6104. 

[2] Bornscheuer, U. T., Huisman, G. W., Kazlauskas, R. J., Lutz, S., Moore, J. C., & Robins, K. (2012). Nature, 485(7397), 185–194.

[3] T. S. Wong, K. L. Tee, B. Hauer, U. Schwaneberg, Nucleic Acids Res 2004, 32, e26

[4] Verma, R., Schwaneberg, U., & Roccatano, D. (2012). ACS Synthetic Biology, 1(4), 139–150.

[5] Cheng, F., Zhu, L., & Schwaneberg, U. (2015). Chemical Communications,51(48), 9760–9772.


文章头图及封面图片来源:lbc.espci.fr

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