报告 | 张    毅

整理 | 王雪征

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2017年7月5日周三下午3点，受北京大学生命科学联合中心饶毅邀请，美国哈佛大学医学院教授张毅在北京大学生命科学学院邓佑才报告厅为师生们做了题为“Epigenetic and chromatin reprogramming at the beginning of mammalian life”的学术报告。

诙谐中稍带戏谑，主持人饶毅对张毅教授进行了介绍（以下删去107字）。

张毅教授首先简要介绍了其实验室早期围绕表观遗传修饰展开的系列工作，包括发现了NuRD(Cell 1998)，PRC2 (Science 2002)，DOT1L (Cell 2003, 2005)，JmjC (Nature 2006)，PRC1(Nature 2004), Tet (Nature 2010, Science 2011) 等诸多重要组蛋白乙酰化、甲基化/去甲基化，泛素化等表观遗传修饰酶类。

接着，张毅教授着重介绍近年来的研究兴趣与成果。

张毅教授课题组近年来研究兴趣包括探索表观遗传调控在神经生物学领域以及早期胚胎发育过程的调控机制。在神经生物学领域，他们着重关注表观遗传调控对动物学习及记忆（reward-related learning and memory）中的功能。他们采用小鼠作为模式生物，以药物成瘾作为记忆的模型，将大脑中不同类型的单个神经细胞进行分离，同时配合单细胞测序技术，分析其转录组学，表观遗传组学等信息，研究在药物成瘾过程前后，不同类型神经元中的生物分子的变化，进而剖析表观遗传调控在此过程中发挥的功能。通过单个神经细胞的分离与测序，可以研究大脑中特定位置以及特定种类的神经细胞进行分析，以期从更精细的层次了解记忆本身的分子机理。在早期胚胎发育领域，他们着重关注表观遗传调控在细胞重编程过程中的作用。

众所周知，体细胞核移植（SCNT）可以使得细胞恢复全能性，第一只克隆羊便因此诞生，但是该项技术的瓶颈在于成功率非常低，常常低于0.4%，而这种低成功率的背后的原因尚未有明确解释。张毅实验室的研究发现，在体细胞核移植实验中，组蛋白H3K9me3的修饰所介导的转录沉默是阻挡细胞重编程进行的一大障碍，加入去甲基化酶Kdm4d就可以使得重编程效率大大增加 (Matoba et al. 2014)。这表明表观遗传调控在细胞重编程中起到了不可或缺的作用。

继而，张毅教授详细介绍了实验室近年来的几项已经发表或即将发表的研究工作。

第一，他们发现，在小鼠合子发育过程中，核小体组装会对核孔复合物的形成产生重要影响。众所周知核小体组装是真核生物染色质形成的必须过程，而早期一些尝试构建去除核小体的染色质突变体常常致死，导致对核小体组装的具体功能的理解无法有效深入。精子受精之前其DNA被鱼精蛋白包被，而在受精之后，才利用母源组蛋白H3.3进行组装成新生核小体。张毅实验室首先发现，精细胞DNA形成雄原核的过程中，新生核小体组装依赖于组蛋白分子伴侣HIRA。利用去除母源的组蛋白H3.3或者去除其分子伴侣HIRA，会导致父本DNA无法形成正常的染色质，从而创造出裸露的DNA结构，可以用来具体研究核小体组装的功能。研究发现，缺乏核小体的结构使得在核孔复合体形成过程中起到关键作用的ELYS蛋白无法正常的定位到细胞核的边缘，导致了核孔复合体无法正常形成，从而出现了缺少核孔复合体的较小的雄原核结构（图1）。因此提出，精细胞DNA新生核小体组装过程对于雄原核的核孔复合体形成起到了关键的作用。

图1，核小体组装对于小鼠合子发育过程中核孔复合物形成的影响(Inoue and Zhang, 2014)。哺乳动物受精过程中，精子DNA原本被鱼精蛋白包被，受精后形成新生核小体，该过程依赖于HIRA介导的H3.3组蛋白呈递过程。本研究通过抑制新生核小体组装过程（右侧），从而构建出一个核小体缺失的染色质系统，由此发现核小体组装缺陷导致核孔复合物形成受损，该过程依赖于ELYS蛋白。同中左侧显示正常受精过程核孔复合物的形成过程。

第二，张毅教授介绍了其实验室在DNA去甲基化研究中的贡献。在胚胎早期发育过程中，DNA上的甲基化修饰会被去除。张毅教授实验室和其他实验室的工作证明，在这个过程中，胞嘧啶上的甲基化在Tet3等蛋白的作用下，被分步氧化，形成醛基或羧基进而通过DNA复制过程的稀释(replication-dependent dilution) 完成去甲基化 (Inoue & Zhang, 2011; Shen et al. 2014)。

第三，张毅教授介绍了他们改进的Low-input DNase-seq技术探索着床前胚胎转录调控元件的工作。该技术的优点在于仅需用少量细胞就可以完成全基因组水平染色质上的DNase I敏感区域（DHS）的检测。其原理是通过DNase I处理可以消化掉染色质没有被蛋白保护的区域，高通量测序就可以展示出基因组水平DHS位点，而这部分位点通常跟转录调控元件密切相关。他们研究表明，这些区域的数量随着胚胎细胞的分裂与分化不断改变，推测与相关转录因子的结合密不可分。转录组学分析发现这些区域确实与基因的表达存在关联。继而深入分析这些区域的序列，比较已知转录因子的结合位点，他们发现，Nfya是参与此过程的重要转录因子。最后，通过比较父源与母源染色质的DHS位点的不同，他们也找到了父源/母源特异性的DHS位点，而且发现它们富集在印迹基因附近（如图2）。

图2，通过Low-input DNase-seq技术研究胚胎发育早期染色质调控元件(Lu et al.)通过Low-input DNase-seq技术，发现伴随着胚胎发育过程，基因组上的核酸酶易感区(Dnase I hypersensitive site, DHS) 区域有所增加（左上）；而通过分析这些区域的序列特征，进而发现了转录因子Nfya是其中一个重要的元件（右上）；父源母源的特异性的DHS位点分布于印记基因启动子附近（左下）；而亲本的DHS区域会很快被重编程（右下）。

最后，张毅教授介绍了部分即将发表的工作 (Inoue et al. 2017，7月19日已在线发表)。

为深入探究父源和母源染色质在胚胎发育过程中的不同模式，他们使用两种不同品系的小鼠进行杂交以区分在受精卵中的亲本DNA来源。在受精后约十二个小时，受精卵细胞中的雌原核与雄原核尚未进行核融合时，分别提取出两个原核，进行Low-input DNase-seq分析。数据表明，在母源和父源的染色质中的DHS区域并不完全相同，其中，约84%的区域为两者共有，13%为父本所特有的区域，3%为母本特有的区域。父本特有的13%的DHS区域可以推测是伴随着雄原核重建染色质结构而形成的新的DHS区域，而其也分布在印记基因和一些其他基因附近。

为了证明这种现象稳定性，他们对两个受精卵中的一对原核互换，从而形成含有两个母源原核或两个父源原核的受精卵，再将这种受精卵培养至桑椹胚时期，进行分析。结果表明，虽然许多父源或母源特有的DHS区域丢失，但仍有部分区域保留了下来。在仅包含两个父源原核的细胞发育形成的桑椹胚中，有约33%父源特有的DHS被保留下来，而仅包含两个母源原核的细胞发育形成的桑椹胚中，有约11%的母源特有的DHS保留了下来，而这些DHS区域分布在所有的印记基因和部分其他基因附近。在遗传印记中，等位基因中仅有一个亲本的基因表达，另一亲本的基因会被转录沉默。

早期研究表明，印记基因附近DNA被甲基化使其转录沉默是调控遗传印记的重要调节机制。然而DNA甲基化过程受阻时，仍有一些印记基因保持了正常的沉默状态，这表明还存在其他调节机制参与到这个过程中。为进一步探讨遗传印记的调控机制，张毅教授实验室对此过程进行探索。已有研究表明，组蛋白H3K27位的甲基化可以抑制DNA甲基化。他们注意到综合他们自己和他人发现的独立于DNA甲基化的印记基因附近富集了H3K27甲基化，暗示H3K27甲基化可能与这个过程密切相关。通过向受精卵中外源注射H3K27me3去甲基化酶Kdm6b，发现这些独立于DNA甲基化的沉默基因附近出现了DHS区域，并检测到该区域转录活性上升。在正常发育时，这些受到H3K27甲基化调节的基因依然能够维持沉默的状态，而注射组蛋白H3K27me3去甲基化酶Kdm6b会导致双亲基因同时表达的情况，小鼠的胚胎发育异常，在注射无活性的去甲基化酶Kdm6b小鼠胚胎可以正常发育，表明H3K27的甲基化是一个全新的遗传印记调节机制。

在互动环节，老师、同学就讲座内容和张毅教授展开热烈地讨论。

其中，关于出色的生化学家应该如何对发育生物学和神经生物学领域做出贡献这一问题，饶毅认为，“重编程的最重要问题（卵细胞含的内源重编程分子）不仅还没有找到，而且很可能最好的方法是生物化学”。

“所以凡是生物化学技术很好的实验室，如果放着这么重要的实验不做，而做其他研究，恐怕很可惜。另外，如果张毅决定研究神经生物学，恐怕也是用生化来研究需要生化技术的神经生物学问题是一个很好的方式，而不是用很多神经生物学家都会的分子生物学方法。”饶毅说。

相关文献：

1. Inoue, A., and Zhang, Y. (2011). Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science 334, 194.

2. Matoba, S., Liu, Y., Lu, F., Iwabuchi, K.A., Shen, L., Inoue, A., and Zhang, Y. (2014). Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell 159, 884-895.

3. Shen, L., Inoue, A., He, J., Liu, Y., Lu, F., and Zhang, Y. (2014). Tet3 and DNA replication mediate demethylation of both the maternal and paternal genomes in mouse zygotes. Cell Stem Cell 15, 459-470.

4. Inoue, A., and Zhang, Y. (2014). Nucleosome assembly is required for nuclear pore complex assembly in mouse zygotes. Nat Struct Mol Biol 21, 609-616.

5. Lu, F., Liu, Y., Inoue, A., Suzuki, T., Zhao, K., and Zhang, Y. (2016). Establishing Chromatin Regulatory Landscape during Mouse Preimplantation Development. Cell 165, 1375-1388.

6. Inoue, A., Jiang, L., Lu, F., Suzuki, T., and Zhang, Y. (2017). Maternal H3K27me3 controls DNA methylation-independent genomic imprinting. Nature (published online July 19, 2017)

本文原发表于微信公众号“生命科学联合中心”（ID：CLS20110418），《知识分子》获授权转载。

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